Expressão heteróloga de neurotoxinas do veneno da aranha Phoneutrianigriventer

• Autor(a) principal: Ivana Assis Souza
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8M7GCR
• topic: Phoneutria nigriventer; Glutamato; Toxinas; Tx3-4 Tx3-6; Canais de cálcio; Expressão heteróloga; Bloqueadores de canais de cálcio; Ácido glutamico; Toxinas biológicas; Venenos de aranha; Canais de calcio; Neurotoxinas

O veneno da aranha Phoneutria nigriventer contém vários peptídeos que atuam em diferentes canais e receptores do sistema nervoso de insetos e mamíferos. As toxinas Tx3-6 e Tx3-4 são bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem e possuem um grande potencial farmacológico no tratamento da dor e na neuroproteção. Como apenas pequenas quantidades de cada toxina podem ser isoladas do veneno, testes farmacológicos e estruturais ficam restritos à obtenção destes peptídeos. Neste trabalho, nós testamos diferentes sistemas de expressão e purificação na tentativa de obtermos as toxinas Tx3-6 e Tx3-4 recombinantes funcionais e em grandes quantidades. A toxina Tx3-6 recombinante expressa no vetor pBADmycHis em E. coli teve efeito analgésico comparável à toxina nativa no teste da formalina em ratos, porém, o rendimento da expressão foi de apenas 0,3 mg/L de cultura. Cerca de 2 mg da mesma toxina foram obtidos no sistema pE-SUMO (E. coli), mas a toxina não teve nenhum efeito no bloqueio de glutamato em sinaptosomas corticais de camundongos. A Tx3-4 também foi expressa no sistema SUMO, de onde foram obtidos cerca de 800 g/L da toxinarecombinante solúvel e funcional e cerca de 3 mg/L da toxina insolúvel que foram renaturados in vitro e renderam 2 mg funcionais. Expressões nos sistemas pPICZ (leveduras), pET (E. coli) e pBADHis (E. coli) foram insatisfatórias devido a baixos rendimentos, expressão em corpos de inclusão e obtenção das toxinas de forma inativa. A caracterização da estrutura secundária da toxina Tx3-4 por dicroísmo circular revelou que a maior parte da sua estrutura apresenta um enovelamento aleatório, mas que a toxina contém também estruturas em -hélice e, em menor quantidade, folhas . Este arranjo é semelhante ao observado para oxytoxinas do veneno da aranha Oxyopes lineatus, que também são bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem. Apesar da disponibilidade de inúmeros sistemas de expressão, a produção de proteínas recombinantes funcionais ainda é uma tarefa difícil. A expressão funcional das toxinas recombinantes Tx3-6 e Tx3-4 criaram novas expectativas para futuros testes farmacológicos e análises estruturais e os resultados obtidos com a renaturação da toxina Tx3-4 abrem novos caminhos para a obtenção de toxinas em larga escala