Mecanismo de catálise e dinâmica protéica da enzima salicilato hidroxilase

• Autor(a) principal: Stefanya Velasquez Gomez
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/SFSA-A8XS4K
• topic: Ácido salicílico; Dinâmica; Oxidativa; Enzima; Salicilato hidroxilas; Descarboxilação; Mecanismo; Química Orgânica; Catálise; Proteinas; Salicilatos; Enzimas

Neste trabalho buscou-se caracterizar a enzima salicilato hidroxilase (NaHG) de Pseudomas putida cepa G7 em relação a sua dinâmica proteica e mecanismo de catálise. Essa enzima participa da via de degradação do naftaleno, sendo uma monooxigenase flavodependente que catalisa, ao custo de NADH e O2, a descarboxilação oxidativa do ácido salicílico (AS)para originar catecol. A análise de dados estruturais obtidos por espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostrou que a NahG não ligada a FAD sofreu uma contração estrutural em relação a holoenzima.No mesmo sentido, a titulação fluorimétrica revelou que a ligação do FAD foi seguida por uma forte supressão da fluorescência em 340 nm e um aumento do rendimento quântico em 524 nm, sugerindo que resíduos de triptofano sofrem uma mudança de meio e próximos ao FAD produziram transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET). Na determinação de parâmetros cinéticos para a NahG observou-se que os valores de Km para FAD e O2são da ordem de concentração utilizadade enzima, indicando que a reação entre O2 e flavina para formar um complexo C4ahidroperoxiflavina foi altamente favorável. Desses resultadosobservou-se que a etapa determinante de velocidade de reação deve ser posterior a qualquer evento de formação da C4a-hidroperoxiflavina. Os dados cinéticos em função do pH para as enzimas nativas e mutantes H110N e H322Y indicam que duas isoformas catalisam a reação de descarboxilação oxidativa do ácido salicílico na NahG. A desprotonação ou mutação dos resíduos de histidina favorece a catálise, mas diminuem a afinidade da NahG pelo AS.Os perfis de Log kcat em função do pH mostram três constantes de ionização, duas dessas constantes foram atribuídas a H110 e ao grupo peroxila da C4ahidroperoxiflavina. Os estudos cinéticos com NahG nativa utilizando como substratos os ácidos salicílicos substituídos mostraram um formato curvo para o perfil de Hammett com Log kcat. Isso indicou mudança da etapa determinante da velocidade de reação, que ocorre por um mecanismo tipo substituição eletrofílica aromática (SEAr).