Redução na expressão da proteína G3BP1 de grânulos de estresse sensibiliza células de glioblastoma tratadas com quimioterápicos

• Autor(a) principal: Lucas Felipe Fernandes Bittencourt
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/35358
• topic: Apoptose; Glioblastoma multiforme; Bortezomib; Etoposídeo; Temozolomida; Grânulos de estresse; G3BP1; U87MG; T98G; Autofagia; Biologia Celular; Apoptose; Glioblastoma; Bortezomib; Etoposídeo; Autofagia

O glioblastoma multiforme é uma enfermidade de baixa incidência, mas de alta letalidade. Um dos principais problemas no tratamento é a resistência deste tipo de tumor à quimioterapia. Nesta linha, esta tese teve como objetivo estudar uma via de resistência a fármacos, conhecida como formação de grânulos de estresse (GS). Os GS são pequenas organelas citoplasmáticas não membranosas que se formam quando uma célula está sujeita a estresse físico ou químico. Sua função é a de proteger mRNAs essenciais para a sobrevida da célula até que o fator estressor seja retirado ou metabolizado. Sua função fisiológica é clara, porém, em se tratando de tumores, esta resposta é corrompida e exacerbada, causando uma grande resistência aos tratamentos empregados no tratamento do câncer. Neste trabalho, então, utilizamos a metodologia de interferência por RNA para diminuir a expressão da principal proteína enucleadora destes grânulos, a G3BP1. Utilizando desta técnica, conseguimos com sucesso reduzir a formação de GS em células das linhagens tumorais T98G e U87MG quando expostas aos quimioterápicos Bortezomib (inibidor de proteassoma - BZM), Etoposídeo (inibidor da topoisomerase II) e Temozolomida (agente alquilante). Observamos redução na viabilidade de células submetidas à inibição de G3BP1 em relação às não inibidas, para todas as drogas. Para elucidar o que levava estas células a morte, focamos na linhagem U87MG e observamos um aumento nos níveis de apoptose pela técnica de citometria de fluxo utilizando marcação de anexina-V e 7-AAD. Este aumento estava presente em células tratadas com BZM e que haviam tido G3BP1 inibida. Confirmamos o aumento de apoptose pelo ensaio de imunoblotting de caspase 3 cliavada. Em seguida realizamos ensaios para determinar o nível de autofagia das células tratadas. Utilizamos o ensaio de acumulo de lisossomos e observamos aumento indireto de autofagia em U87 tratada com TMZ. Para elucidar este efeito usamos laranja de acridina (AO) em ensaio de vesículas acídicas por time-course, o que revelou aumento no acumulo destas vesículas para ETO e TMZ em 8H para U87 e 10-12H BZM/ETO e TMZ, respectivamente para T98. Como AO já marca lisossomos e autofagossomos maduros, queríamos observar se a expressão de LC3B havia sido modulada, anteriormente a maturação lisossomal. Por citometria de fluxo conseguimos observar aumento na expressão de LC3B para TMZ em 6 e 8H (U87 e T98, respectivamente). Paralelamente, observamos que a inibição de G3BP1 também leva à diminuição de angiogênese induzida por células U87 tratadas com BZM e essa diminuição não VEGF- dependente. Podemos concluir que, autofagia provavelmente tem um papel decisivo na redução de viabilidade de U87 com inibição de GS e tratamento com TMZ. Também concluímos que, a inibição de GS potencializa resposta apoptótica, reduzindo a viabilidade celular e diminui a angiogênese em células da linhagem U87MG tratadas com o quimioterápico BZM.