Análise do DNA mitocondrial como ferramenta para identificação de espécies do subgênero Leishmania Viannia (Lainson & Shaw, 1987)

• Autor(a) principal: Isabella Figueiredo de Andrade
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/54921
• topic: Leishmaniose; Subgênero Leishmania (Viannia); DNA mitocondrial; SNPs; Leishmaniose; Leishmania Viannia; DNA mitocondrial; Bioquímica

A leishmaniose é uma doença vetorial crônica causada por protozoários flagelados do gênero Leishmania (Ross, 1903) que são divididos em dois subgêneros, o Viannia e o Leishmania. Ela pode se manifestar em duas formas principais: visceral e tegumentar (LT); sendo a última dividida em cutânea simples, cutânea disseminada, cutânea difusa e mucocutânea. O foco deste trabalho foi nas espécies causadoras de LT, do subgênero Viannia. No Brasil são mais de 25 mil casos de LT por ano e ela é considerada pela Organização Mundial de Saúde uma das seis principais doenças infecciosas. A Leishmania (Viannia) braziliensis é a principal espécie causadora da forma tegumentar no Brasil. Atualmente, os métodos para diagnóstico utilizados na prática clínica são baseados em resposta imunológica (teste de intradermorreação) e exame microscópico direto da amostra coletada no local de lesão, corada pelos corantes tipo Romanowsky. Tais métodos são eficazes para o diagnóstico da doença, porém não permitem a determinação da espécie presente. A determinação da espécie presente é importante para direcionar o melhor tratamento para a doença e seu prognóstico, visto que algumas espécies respondem melhor com determinadas drogas e diferentes quantidades da terapia. A identificação das espécies é possível através da eletroforese de isoenzimas, porém esta técnica depende da cultura dos parasitos da lesão para se obter quantidade suficiente de proteínas, está sujeita à contaminação por bactérias e leveduras, é de difícil interpretação e o resultado pode levar de 3 a 5 semanas para ser disponibilizado, inviabilizando seu uso na clínica. A busca por metodologias moleculares que envolvam a reação em cadeia da polimerase (PCR) é recente, mais ainda as que se baseiam no DNA mitocondrial (kDNA). O maior problema nesta metodologia é a escassez de sequências de kDNA no GenBank do NCBI, principalmente para as espécies do subgênero Viannia. Sendo assim, o objetivo do nosso trabalho foi o de pesquisar genes candidatos a identificação das espécies causadoras de leishmaniose tegumentar, com foco nas do subgênero Viannia e enriquecer o GenBank com novas sequências para estudos futuros. Para isso, utilizamos duas abordagens. A primeira teve como objetivo a amplificação dos genes ATPase subunidade 6 (ATP6), Citocromo Oxidase subunidade II (COII), Citocromo Oxidase subunidade III (COIII) e Citocromo b (Cyt b) de cepas referência de espécies do subgênero Viannia. A segunda teve como objetivo a amplificação completa da região codificadora do maxicírculo da Leishmania (V.) braziliensis cepa M2903 com a finalidade de fornecer mais sequências gênicas para estudos diversos. A primeira parte do nosso trabalho gerou 27 novas sequências e todas elas foram analisadas quanto a presença de sítios polimórficos, capazes de permitir a identificação das espécies do subgênero Viannia. O gene que se mostrou melhor candidato para desenvolvimento de uma metodologia que envolva iniciadores alelo específicos foi o gene Cyt b. Porém mais genes devem ser estudados e outras cepas incluídas na análise. A segunda parte do trabalho nos forneceu a sequência de 16 genes do maxicírculo do kDNA, possibilitando assim mais genes para serem estudados quanto a possibilidade de se tornarem alvos para diagnóstico molecular espécie-específico.