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Daniel Santos MansurAristobolo Mendes da SilvaDaniella Castanheira BartholomeuPatricia Torres BozzaJuliano BordignonRenata Cristina Fleith2019-08-11T00:22:33Z2019-08-11T00:22:33Z2018-12-14http://hdl.handle.net/1843/BUOS-B96EQWEntre os genes estimulados por interferon mais expressos está a família das IFITs (proteínas induzidas por interferon com repetições de tetratricopeptídeos). IFIT1 é uma molécula efetora crítica da imunidade antiviral intrínseca das células, que se liga principalmente a RNAs sem a 2´-O-metilação no primeiro e segundo nucleotídeos proximais ao cap (cap0), característica essa de RNAs não próprios. Após a ligação, IFIT1 previne a tradução desses RNAs por competir com o fator eucariótico de iniciação da tradução 4F. Mesmo IFIT1 podendo ligar-se diretamente a esses RNAs, já foi demonstrado que ela interage com muitas outras proteínas, incluindo outras IFITs, em células estimulados por interferon. Entretanto, os detalhes moleculares dessas interações e o seu impacto na atividade de IFIT1 ainda não tinham sido mostrados. Os complexos de IFITs humanas foram aqui reconstituídos em experimentos de gel filtração utilizando proteínas recombinantes, e sua estequiometria foi determinada por SEC-MALS. IFIT1 interage fortemente com IFIT3 para formar um heterotetrâmero estável. Os homodímeros de IFIT2 e IFIT3 dissociam-se para formar um heterodímero mais estável, que interage com IFIT1 em um heterotrímero de IFIT1:IFIT2:IFIT3. A presença de IFIT3 nesses complexos aumenta sua estabilidade, como demonstrado por fluorimetria de varredura diferencial. A associação de IFIT3 e IFIT2:IFIT3 também potencializam a ligação de IFIT1 a RNAs modelo contendo cap0 em ensaios de inibição da extensão do iniciador e a inibição da tradução desses alvos in vitro. Por meio de mutações, a interface de ligação IFIT1:IFIT3 foi identificada como um motivo conservado YxxxL na região C-terminal de ambas as proteínas. Alterações nessa interface anulam a potencialização da atividade de IFIT1 dependente de IFIT3. Em células, foi demonstrado que IFIT3, mas não IFIT2, estabiliza a expressão de IFIT1. Por fim, um sistema de co-precipitação in vitro foi desenvolvido para identificar interações do complexo IFIT1:IFIT2:IFIT3 com mRNAs celulares próprios. Os RNAs ligados foram sequenciados em profundidade e a sua expressão proteica avaliada no contexto da super-expressão de IFIT1. Juntos, esses dados revelam novos papéis para IFIT3, esclarecem aspectos críticos da montagem e função dos complexos de IFITs e trazem novas pistas a respeito do mecanismo de inibição da tradução celular mediado por IFIT1.Among the most highly expressed interferon stimulated genes are members of IFIT family (interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats). IFIT1 is a critical effector molecule of the antiviral cell-intrinsic immunity that binds mainly cap0 RNAs, which lack 2´-O-methylation of the first and second cap-proximal nucleotides (cap0), characteristic of non-self RNAs. After binding, IFIT1 prevents their translation by competing with the cap-binding eukaryotic translation initiation factor 4F. Despite IFIT1 can bind RNAs by itself, it was demonstrated that it interacts with several proteins, including other IFITs in cells stimulated with interferon. However, the molecular details of these interactions and the impact on IFIT1 activity wasn´t shown. The human IFITcomplexes were here reconstructed in gel filtration experiments using recombinant proteins, and their stoichiometry were determined by SEC-MALS. IFIT1 strongly interacts with IFIT3 to form a stable heterotetramer. IFIT2 and IFIT3 homodimers dissociate to form a more stable heterodimer that interacts with IFIT1 in a heterotrimer of IFIT1:IFIT2:IFIT3. The presence of IFIT3 in these complexes increases their stability as demonstrated by differential scanning fluorimetry. IFIT3 and IFIT2:IFIT3 association also enhanced IFIT1 binding to model cap0 RNAs in toeprinting assays and the translation inhibition of its targets in vitro. By mutational analysis, the IFIT1:IFIT3 binding interface were identified as a conserved C-terminal YxxxL motif present in both proteins. Disruption of this interface abrogates IFIT3-dependent IFIT1 enhanced activity. In cells, it was demonstrated that IFIT3, but not IFIT2, stabilizes IFIT1 expression. Finally, an in vitro pulldown system were developed to identify IFIT1:IFIT2:IFIT3 interactions with cellular self mRNAs. Bound RNAs were deep sequenced and their protein expression evaluated in the context of IFIT1 overexpression. Together this work reveals new roles for IFIT3, clarifies the critical aspects of IFIT complexes assembly and function, and brings new clues to the mechanism of IFIT1-mediated cell translation inhibition.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGInterferon Tipo IBioinformáticaRepetições de TetratricopeptídeosBioinformáticaCaracterização dos complexos de IFITS humanas e seu impacto na tradução celularinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtese_artigos_final_renata_cristina_fleith.pdfapplication/pdf12211132https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-B96EQW/1/tese_artigos_final_renata_cristina_fleith.pdf72bad267af6b89e723d6274cfc6d004cMD51TEXTtese_artigos_final_renata_cristina_fleith.pdf.txttese_artigos_final_renata_cristina_fleith.pdf.txtExtracted texttext/plain383341https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-B96EQW/2/tese_artigos_final_renata_cristina_fleith.pdf.txtf7f9574bada6d2d47de04e928e573f8fMD521843/BUOS-B96EQW2019-11-14 11:29:40.784oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUOS-B96EQWRepositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T14:29:40Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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