Desenvolvimento de PCR convencional e em tempo real para o Vírus da Língua Azul

• Autor(a) principal: Fábia Souza Campos
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9AKGNN
• topic: em tempo real; Diagnóstico do Vírus da Língua Azul; PCR convencional; PCR; Língua Azul; Virus da Lingua Azul

A Língua Azul (LA) é uma doença infecciosa não contagiosa que apresenta importantes impactos sócio-econômicos decorrentes de restrições na importação e ou por perdas diretas nos rebanhos infectados com o vírus da língua azul (BTV). O BTV é um membro da família Reoviridae, gênero Orbivirus, transmitido por um vetor artrópode do gênero Culicoides. O BTV pode afetar ruminantes domésticos e selvagens, porém a doença clínica é grave especialmente em ovinos e algumas espécies de cervos. Até o momento, 24 sorotipos são descritos na literatura. O BTV é endêmico em várias partes do mundo, incluindo a África e regiões dos EUA, Austrália e Ásia. Este trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional e em tempo real para a detecção do BTV. Apósextração do RNA foi realizada transcrição reversa seguida de uma PCR convencional e em tempo real utilizando iniciadores específicos para o gene que codifica a proteína não estrutural NS3 do BTV, produzindo um fragmento de 256pb. Os testes padronizados foram realizados com amostras de sangue e sêmen de bovinos infectados experimentalmente com BTV-4. Os resultados demonstraram que houve a amplificação do fragmento de tamanho esperado (256pb), validando, assim, o protocolo desenvolvido para PCR convencional e PCR em tempo real. A partir da técnica de PCR convencional foi detectado uma sensibilidade analítica de 30 fg, utilizando-se cDNA da suspensão do BTV-4, e de 250 ag de ácido nucléico (10-18ag), utilizando-se o DNA plasmidial como molde. Os resultados da PCR em tempo real, de acordo com a curva padrão, apresentaram coeficiente de determinação (R2) em torno de 0,998 e slope de -3,528, revelando uma eficiência de amplificação de aproximadamente 92%, mostrando-se confiável para a detecção do BTV. A PCR convencional e a PCR em tempo real também foram testadas em amostras de sangue de bovinos, caprinos e ovinos provenientes de uma propriedade de MG, com suspeita de doença erosiva. Todos os ensaios aqui apresentados apontaram que a PCR em tempo real foi capaz de detectar o BTV com uma sensibilidade e especificidade satisfatória podendo ser usada nas amostras experimentalmente e naturalmente infectadas.