Construção de um Vaccinia vírus recombinante expressando a proteína Tirosina Fosfatase 1B (PTP1B)

• Autor(a) principal: Mariana Araújo Costa
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/42408
• topic: Vaccinia virus; PTP1B; Egr-1; Vírus recombinante; Expressão de proteína; Microbiologia; Vírus Vaccinia; Proteínas Tirosina Fosfatases; Genes Precoces; DNA Recombinante

Os poxvírus são uma família de vírus de DNA que se multiplicam inteiramente no citoplasma das células, estes vírus apresentam um amplo espectro de hospedeiro podendo infectar tanto seres vertebrados e invertebrados, para isto estes vírus co-optam vias sinalização celular do hospedeiro, criando um ambiente propício para o estabelecimento da infecção. Em estudos anteriores do nosso grupo, foi possível verificar que o Vaccinia virus (VACV) ativa a via MEK/ERK, induzindo o acúmulo dos fatores de transcrição, tais como Egr-1, ATF-2, c-Fos e c-Jun. A estimulação da expressão de Egr-1 mostrou-se importante para a multiplicação do VACV, e para a disseminação célula-a-célula de partículas virais envelopadas (EV) do VACV e do Cowpox virus (CPXV). Umas das hipóteses investigadas pelo nosso grupo é a de que o efeito de Egr-1 na disseminação de partículas EV se dá através da regulação da expressão de outro fator do hospedeiro, a Proteína Tirosina Fosfatase 1B (PTP1B). Dessa forma, a ativação de Egr-1 induzida por poxvírus levaria à repressão da expressão de PTP1B, o que permitiria a ativação de cinases fundamentais para o processo de formação de caudas de actina que propelem formas EV para células vizinhas não infectadas. De forma a corroborar a hipótese acima, o objetivo deste estudo foi criar um VACV recombinante no qual a expressão de PTP1B pode ser controlada por IPTG, para avaliar se o papel facilitador de Egr-1 na disseminação do VACV se deve à regulação da expressão da fosfatase PTP1B. A introdução do gene ptp1b se deu por recombinação homóloga no locus do gene A56R (hemaglutinina, HA) da amostra de VACV vT7lacOI utilizando o vetor de transferência pVOTE.1/PTP1B. Após a recombinação foi realizada a seleção do vírus recombinante (vT7lacOI/PTP1B) em células BSC-40 e MEF, a confirmação e validação da expressão exógena de PTP1B por “Transferência de Western” (WB), sequenciamento, imunofluorescência (IF) e RT-PCR. Os resultados obtidos demonstram que a expressão de PTP1B regulada por IPTG ocorreu satisfatoriamente. Em seguida, para corroborar que a expressão de PTP1B é regulada por Egr-1, MEF WT e knockouts para egr-1 foram infectados com o vT7lacOI/PTP1B e a expressão de PTP1B avaliada por WB. Nossos dados demonstram um acúmulo de PTP1B na ausência de Egr-1 durante a infecção pelo VACV, e evidenciam o aumento nos níveis de PTP1B após o tratamento das células infectadas com IPTG. Em conjunto, construiu-se uma ferramenta útil para análise do papel do acúmulo de PTP1B na biologia viral do VACV. Isso possibilitará a investigação mais detalhada do papel de PTP1B na liberação de partículas EV dos poxvírus.