Clonagem, expressão e purificação das enzimas NahE e NahK de Pseudomonas putida para determinação de suas estruturas cristalográficas

• Autor(a) principal: Samuel Leite Guimarães
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUOS-962K2C
• topic: Biorremediação; Naftaleno; Pseudomonas; Bioquímica; Biorremediação; Naftaleno; Pseudomonas

Devido ao uso do petróleo e seus derivados, diversos tipos de poluentes são liberados no meio ambiente. Alguns deles são classificados como Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs). A maioria dos HAPs, ou seus metabólitos, são capazes de interagir com bases nitrogenadas causando lesões no DNA, potencializando mutações e, consequentemente, o desenvolvimento de câncer. Como resultado disso, houve nas últimas décadas um aumento substancial na atenção dada às contaminações de solos e lençóis freáticos por HAPs. Inúmeros microrganismos possuem a capacidade de utilizar essas moléculas tóxicas como fontes de carbono e energia. O uso de determinadas bactérias (ou de suas enzimas) através de técnicas de biorremediação é uma estratégia em potencial para eliminação dos HAPs do ambiente. O HAP mais comum e tóxico é o naftaleno, e graças à capacidade da bactéria Pseudomonas putida em degradá-lo completamente, ela tem sido o foco de inúmeras pesquisas. Neste trabalho foram estudadas duas enzimas de P. putida envolvidas na degradação de naftaleno: NahE (uma hidratase-aldolase) e NahK (uma decarboxilase). O objetivo principal do trabalho foi a amplificação e clonagem dos genes nahE e nahK, expressão e purificação das respectivas enzimas para ensaios bioquímicos e estruturais. Os genes foram clonados inicialmente no vetor de expressão pET28a-TEV e expressos em Escherichia coli. A proteína recombinante NahE foi detectada em fração insolúvel e diversas estratégias foram utilizadas, sem sucesso, para obtenção da proteína expressa em fração solúvel. NahE solúvel foi obtida utilizando purificação em condições desnaturantes seguida por reenovelamento. Por outro lado, a proteína recombinante NahK foi detectada em fração solúvel e purificada por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. As proteínas purificadas foram submetidas a ensaios de Espalhamento Dinâmico de Luz e Dicroísmo Circular. Também foram realizados ensaios de cristalização com NahK visando o crescimento de cristais para a elucidação de sua estrutura tridimensional por cristalografia de Raios-X.