Avaliação de diferentes protocolos para edição gênica pela metodologia CRISPR/Cas9 em Leishmania amazonensis.

• Autor(a) principal: Carlos Rodolpho Ferreira Brasil
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/48898
• topic: CRISPR/Cas9; Leishmania; Leishmania amazonensis; knockout gênico; transportador de miltefosina

O sistema CRISPR/Cas9 tem sido considerado uma ferramenta revolucionária para edição gênica em vários organismos. Os knockouts e knock-ins gerados por CRISPR/Cas9 permitem melhor entendimento dos impactos celulares, metabólicos e estruturais causados pela adição ou remoção de algum componente, podendo resultar em avanços no desenvolvimento de vacinas, diagnostico ou intervenções terapêuticas. CRISPR/Cas9 já foi aplicado para diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania, mas não para Leishmania amazonensis, um dos agentes etiológicos mais importantes de leishmaniose tegumentar. No presente trabalho, testamos diferentes protocolos de CRISPR/Cas9 para induzir o knockout no Transportador de Miltefosina (TM) de L. amazonensis como prova de conceito. A expressão da Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) com a transfecção de dois plasmídeos: pLDCN, um vetor epissomal e pRM006, que possui braços de homologia com sequências de UTR de genes de beta-tubulina, promovendo recombinação homóloga e integração no genoma. Uma sequência doadora contendo três códons de terminação in tandem, um sítio de restrição para HindIII e braços de homologia de 30pb foram, também, dados às células transfectadas para guiar o reparo da quebra da dupla fita de DNA por homologia. Alternativamente, expressamos em Escherichia coli a Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9) e confirmamos sua atividade in vitro. Formas promastigotas foram transfectadas com o complexo ribonucleoproteico SaCas9 recombinante e um SgRNA. Foi constatada edição gênica de TM em parasitos transfectados com pLDCN e RNA guia transcrito in vitro, delineado para essa espécie, apesar das limitações associadas ao genoma de L. amazonensis disponível, assim como para SaCas9 recombinante. Parasitos transfectados com pRM006 perderam a resistência à higromicina e não foram editados. A cepa gerada com SaCas9 recombinante se mostrou aproximadamente 6 vezes mais resistente que os parasitos selvagens à miltefosina. Avaliamos ainda a infectividade de parasitos mutantes para macrófagos da medula óssea de camundongos. No entanto, não foi observada diferença significativa nas taxas de infecção, quando comparados aos parasitas wild type. Em conjunto, nossos resultados demonstraram a possibilidade de edição do genoma de L. amazonensis por diferentes protocolos de CRISPR/Cas9, que podem ainda ser otimizados. Os parasitos resistentes a miltefosina podem agora ser melhor caracterizados em relação a alterações fenotípicas decorrentes da edição do gene TM.