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Anderson MiyoshiSophie Yvette LeclercqAlvaro Cantini NunesDawidson Assis GomesVanessa Bastos Pereira2019-08-11T08:24:52Z2019-08-11T08:24:52Z2011-02-16http://hdl.handle.net/1843/BUOS-8EMR7CO uso de bactérias como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais pela rota oral constitui uma estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para isto, bactérias patogênicas atenuadas como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, ainda que as mesmas apresentem risco de reversão ao seu fenótipo selvagem. Sendo assim, a utilização de bactérias não patogênicas poderia constituir uma alternativa mais segura para este propósito. Lactococcus lactis é uma bactéria láctica modelo considerada GRAS (Generally Recognized As Safe) que vem sendo extensivamente utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Assim, L. lactis pode representar uma alternativa para a entrega de plasmídeos vacinais em relação aos patógenos atenuados, ainda que o mesmo não tenha capacidade invasiva. Neste contexto, foram construídas linhagens de L. lactis invasivas (L. lactis FnBPA, Innocentin et al., 2009) e também um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica (pValac, Guimarães et al., 2009). Assim, a utilização de uma linhagem invasiva de L. lactis contendo o vetor pValac para a expressão eucariótica do antígeno ESAT-6 (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) de Mycobacterium tuberculosis, pode vir a ser uma nova estratégia para o controle da tuberculose; uma doença infecto-contagiosa que atinge 1/3 da população mundial na forma latente. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a construção do plasmídeo vacinal pValac:ESAT-6 e verificação de sua funcionalidade, in vitro, assim como a clonagem na linhagem invasiva de L. lactis para sua utilização como uma via de entrega oral de vacinas gênicas. A seqüência codificadora de ESAT-6 foi isolada por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis linhagem H37Rv para clonagem no vetor Zero Blunt® TOPO® e posteriormente no vetor pValac. A construção final, pValac:ESAT-6, foi primeiramente obtida em Escherichia coli TG1. Para a avaliação da funcionalidade do plasmídeo, células da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary) foram transfectadas com o plasmídeo pValac:ESAT-6 e a expressão de ESAT-6 foi avaliada por RT-PCR, Western blotting e Imunocitoquímica, sendo, a funcionalidade do plasmídeo pValac:ESAT-6, assim confirmada. Por fim, o plasmídeo pValac:ESAT-6 foi transformado na linhagem invasiva de L. lactis, gerando a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Enfim, este trabalho constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração oral em mucosas; o que também poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.The use of bacteria as vehicles for the delivery of vaccine plasmids by oral route constitutes a promising strategy for vaccination against various infectious diseases. Attenuated pathogenic bacteria such as Shigella, Listeria and Salmonella have been widely used for such purposes, although presenting potential risk to revert into their wild-type phenotype. In this regard, the use of non-pathogenic bacteria, such as lactic acid bacteria (LAB), constitutes a more attractive and safe alternative. Lactococcus lactis, which belongs to the LAB group, obtained the GRAS (Generally Recognized As Safe) status due to their lack of pathogenicity and has been extensively used for the production and delivery of antigens and cytokines to the mucosal level. As such, L. lactis represents an alternative to attenuated pathogenic bacteria for the delivery of vaccine plasmids although not having invasive capacity; hence, invasive L. lactis strains (L. lactis FnBPA, Innocentin et al., 2009) as well as a plasmid that replicates in L. lactis and contains a eukaryotic expression cassette (pValac, Guimarães et al., 2009) were constructed. It is therefore believed that the use of invasive L. lactis containing the pValac vector, for eukaryotic expression of the ESAT-6 antigen (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) of Mycobacterium tuberculosis, could represent a newstrategy for controlling Tuberculosis, an infectious disease that affects, in latent form, 1/3 of the worlds population. Thus, the goal of this project was to construct the plasmid vaccine pValac:ESAT-6, verify its functionality in vitro, its cloning capacity into the invasive strain of L. lactis and its use as delivery vehicle of an oral DNA vaccine. For this purpose, the coding sequence of ESAT-6 was isolated by PCR from the genomic DNA of M. tuberculosis strain H37Rv, cloned into the vector Zero Blunt ® TOPO ® and subsequently into pValac. The final construct pValac:ESAT-6 was first obtained in Escherichia coli TG1. In order to evaluate the functionality of the plasmid, CHO (Chinese Hamster Ovary) cell lines were transfected with the plasmid pValac:ESAT-6 and the ESAT-6 expression evaluated by RT-PCR, Western blotting and immunocytochemistry; in doing so, the functionality of the pValac:ESAT-6 plasmid was confirmed. Finally, the plasmid pValac:ESAT-6 was transformed into the invasive strain of L. lactis generating the strain L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). This workconstitutes a first step towards validation of the efficiency and effectiveness of a new genetic vaccine based on genetically modified LAB and oral administration through mucous membranes, which may provide valuable information for research and for the development of vaccines against other pathogens.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGLactococcus lactisAntígenosPlasmideosGenéticaTuberculoseVacinasVacinas de DNAGenéticaConstrução e avaliação funcional de um plasmídeo vacinal para a expressão do antígeno ESAT-6 de Mycobacterium Tuberculosis em células mamíferas, utilizando uma bactéria láctica invasiva como veículo carreadorinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALdisserta_ao_final_vanessa_pdf.pdfapplication/pdf4847471https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-8EMR7C/1/disserta_ao_final_vanessa_pdf.pdf9b97260bb9b268fd147df853dfa228baMD51TEXTdisserta_ao_final_vanessa_pdf.pdf.txtdisserta_ao_final_vanessa_pdf.pdf.txtExtracted texttext/plain260275https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-8EMR7C/2/disserta_ao_final_vanessa_pdf.pdf.txt8b44fb999948d970069ed78cf44a93a0MD521843/BUOS-8EMR7C2019-11-14 10:26:03.434oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUOS-8EMR7CRepositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T13:26:03Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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