Peptídeos antimicrobianos: síntese, ensaios biológicos, estudos termodinâmicos e análise estrutural por RMN em meios biomiméticos

• Autor(a) principal: Rodrigo Moreira Verly
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/SFSA-876NDM
• topic: Síntese; antibióticos; Peptídeos antimicrobianos; Peptidios Sintese; Sequencia de aminoacidos; Química orgânica; Produtos de ação antimicrobiana

Muitos organismos empregam substâncias químicas ativas como, por exemplo, aminas, derivados de esteróides, alcalóides e peptídeos para se defender de predadores e de microrganismos patogênicos. Dentre essas substâncias químicas destacam-se os peptídeos que podem ser encontrados em uma vasta variedade de organismos, incluindo bactérias, fungos, plantas, insetos, peixes, anfíbios, aracnídeos e mamíferos. A grande maioria destes peptídeos apresenta propriedade antimicrobiana cujo mecanismo de ação não depende da interação com um receptor específico, tornando-os opções alternativas aos antibióticos disponíveis comercialmente. Entretanto, o mecanismo pelo qual peptídeos exercem sua atividade antimicrobiana ainda não é completamente definido e muitos estudos são necessários para uma maior compreensão do modo de ação destas moléculas em células bacteriana. O presente estudo teve como objetivo geral obter informações termodinâmicas e estruturais de peptídeos antimicrobianos em ambientes que mimetizam membranas biológicas, buscando contribuir para o entendimento de seus mecanismos de ação. Neste trabalho foram sintetizados por técnica manual, pela síntese em fase sólida, os peptídeos dermadistinctina K (DD K), homotarsinina (HMT-2) e LyeTx I. O peptídeo antimicrobiano DD K foi isolado previamente da pele do anfíbio Phyllomedusa distincta. O efeito do colesterol na interação do peptídeo sintético DD K com lipossomas de 1,2-dipalmitolifosfatidilcolina foi investigado por medidas de cinética de extravasamento de carboxifluoresceína (CF), espalhamento de luz dinâmica (DLS) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de liberação de CF foi significativamente reduzida pela presença de colesterol. Os resultados de DLS mostraram um aumento no tamanho dos lipossomas sem colesterol quando titulados com DD K, porém a adição de colesterol reduziu o efeito de DD K no aumento do tamanho dos lipossomas. Os estudos por ITC demonstraram também que a ligação de DD K com lipossomas é significativamente afetada pelo colesterol, o que contribui para explicar a baixa atividade hemolítica do peptídeo. As preferências conformacionais de DD K foram estudadas por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) na presença de ambientes miméticos de membranas, como trifluoroetanol/água (TFE/H2O), micelas de dodecifosfocolina (DPC) e dodecilsufato de sódio (SDS) ou lipossomas de palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC) e de palmitoil-oleoil-fosfatidilglicerol (POPG). Os resultados mostraram que o DD K apresenta uma estrutura randômica em meio aquoso, porém ao se associar à membrana adota uma conformação helicoidal. Assim, a estrutura tridimensional de DD K foi estudada na presença de micelas DPC por espectroscopia bidimensional de RMN em solução. Os resultados mostraram uma conformação -hélice anfipática a partir do sétimo resíduo e que se estende até a região C-terminal. Neste trabalho foram realizados também os estudos estruturais, termodinâmicos e biológicos comparativos entre o peptídeo antimicrobiano homotarsinina (HMT-2), isolado de anuros da espécie Phyllomedusa tarsius, e sua forma monomérica (HMT-1). O peptídeo de ocorrência natural HMT-2 mostrou-se mais ativo contra as bactérias Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa do que sua cadeia monomérica HMT-1. Os resultados termodinâmicos indicaram maior interação do peptídeo dimérico com lipossomas de POPC e POPG em relação ao peptídeo monomérico, justificando a maior atividade antimicrobiana de HMT-2. Comparações entre resultados de CD revelaram maior propensão à formação de estrutura -helicoidal de HMT-2 do que HMT-1. Os estudos detalhados das estruturas tri-dimensionais por RMN mostraram diferenças significativas na orientação das cadeias monoméricas de HMT-2 em meio aquoso e em ambiente de membrana. A estrutura mais fechada de HMT-2 em solução aquosa pode indicar um mecanismo de proteção do peptídeo frentea proteases, enquanto uma estrutura estendida, formada em micelas de DPC, leva a uma maior superfície de contato entre peptídeo e membrana. O peptídeo LyeTx I, isolado do veneno de Lycosa erythrognata, conhecida como aranha lobo, foi sintetizado para estudos de sua atividade antimicrobiana e determinação estrutural por CD e RMN. As comparações dos ensaios antimicrobianos de LyeTx I e fármacos comerciais mostraram que o peptídeo é ativo contra as bactérias Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Os resultados de CD mostraram que LyeTx I na presença de POPC contendo colesterol tem uma diminuição na conformação helicoidal e, juntamente com a baixa atividade hemolítica, indicam que as membranas bacterianas são alvos preferenciais em relação a membranas de vertebrados. Os resultados de RMN de LyeTx I apontam para uma pequena estruturação da região N-terminal seguida por uma -hélice do sexto resíduo até a região C-terminal amidada, o que pode favorecer a interação peptídeo-membrana.