Regulação do transporte de lactose em Kluyveromyces lactis JA6.

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Ana Maria dos
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFOP
Texto Completo: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/6554
Resumo: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
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spelling Regulação do transporte de lactose em Kluyveromyces lactis JA6.LactoseFarmacocinéticaMicrobiologiaPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.Kluyveromyces lactis é uma levedura capaz de fermentar a lactose e por isso é considerada como modelo alternativo para estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos de leveduras não Saccharomyces. Compreender os mecanismos de captação de lactose e a regulação envolvida no transporte é um passo importante para melhores aplicações biotecnológicas destas células. O transporte de lactose, em K. lactis é mediado por uma permease da membrana, codificada pelo gene LAC12. Nesse estudo as estirpes utilizadas foram a K. lactis JA6 e a K. lactis JA6 LAC12-GFP. As células foram cultivadas em meio YNB completo, suplementado com diferentes fontes de carbono (lactose, galactose, glicose e glicerol (3% w/w)) a uma concentração de 2% (w / v), em uma incubadora orbital a 30 ° C. As células foram colhidas no meio de fase exponencial, lavadas por três vezes com água fria, resuspensas em 100 mM Tris / tampão de citrato, pH 5.0 para medições de transporte de [D-glucose-1-14C] lactose. A cinética da taxa inicial de captação de [D-glucose-1-14] lactose foi investigada numa gama de concentrações de 0,025 a 10 mM de lactose. Galactose foi testada como inibidor competitivo do transporte de lactose, uma vez que em K. lactis Lac12p também foi descrito como transportador de galactose. Para estudar o efeito da glicose no transporte de lactose, as células foram cultivadas em lactose e divididas em duas alíquotas (controlo e 100 mM de glicose adicionada). As células foram colhidas, lavadas e a captação inicial de lactose foi medida. A taxa de captação inicial de [D-glucose-1-14C] lactose também foi investigada em células cultivadas em glicose e transferidas para lactose na presença / ausência de cicloheximida ou Higromicina B. A localização do transportador Lac12-GFP foi investigada em células crescidas em glicose e em células transferidas para lactose, ou galactose, ou glicerol. O perfil de consumo de açúcares por células de K.lactis foi analisado através de HPLC. Os resultados mostraram que o transporte de lactose em células cultivadas em 2% de lactose obedece a uma cinética de saturação. A constante de afinidade (Ks) foi de 1,49 ± 0,38 mM e a velocidade máxima (Vmáx) foi 953,47 ± 116,24 μmoles.h-1.g-1. O mesmo sistema de transporte estava presente em células cultivadas em galactose e glicerol. As células cultivadas em 2% (w/v) de glicose transportaram a lactose em taxas muito baixas. No entanto, quando as células crescidas em glicose foram transferidas para 2% (w/v) de lactose, o transporte exibe recuperação parcial. Esta recuperação não parece requerer a síntese de proteínas uma vez que cicloheximida e higromicina B não impediram a desrepressão parcial. Além disso, o transporte de lactose não é inativado pela glicose. A localização sub celular do transportador Lac12 é dependente da fonte de carbono e da sua concentração. O consumo de glicose e lactose é simultâneo apesar da glicose retardar o consumo da lactose. O consumo de lactose é preferencial ao de galactose quando os dois açúcares estão presentes simultaneamente. Estes dados nos permitem inferir que o sistema de transporte de lactose em K. lactis JA6 é constitutivo e que a glicose exerce um controle não muito claro no transporte lactose. Provavelmente, este controle envolve mecanismos transcricionais e postranscricional.Kluyveromyces lactis is able to ferment lactose and it is considered as an alternative model for biochemical, physiological and genetic studies in non-Saccharomyces yeasts. Understanding the mechanisms of lactose uptake and the regulation involved in the transport is an important step towards better biotechnological applications. The transport of lactose in K. lactis is mediated by a membrane permease encoded by the LAC12 gene. In this study we used the strains K. lactis JA6 and K. lactis JA6 LAC12-GFP. Cells were harvested in mid-exponential growth phase, washed with cold distilled water, resuspended in 100 mM Tris/citrate buffer, pH 5.0 for [D-glucose-1-14C] lactose transport measurements. The kinetics of the initial rate of uptake [D-glucose-1-14C] lactose was investigated in the range of concentration of 0.025 to 10 mM. Galactose was tested as competitive inhibitor of lactose transport since this system also transport galactose. To study the effect of glucose on lactose transport, cells were grown on lactose and divided in two aliquots (control and 100 mM glucose added). Cells were harvested, washed and the uptake was measured. The initial uptake rate of [D-glucose-1-14C] lactose was also investigated in cells grown on glucose and transferred to lactose in the presence/absence of cycloheximide or Hygromycin B. The sub-cellular localization of the carrier Lac12-GFP was investigated in glucose grown cells and after the transference to lactose or galactose or glycerol. The sugar consumption profile of K.lactis was analyzed by HPLC chromatography. The results indicate that the transport of lactose into cells grown on 2% lactose follows the kinetics of saturation.The half-saturation constant (Ks) was 1.49 ± 0.38 mM and the maximum velocity (Vmax) was 953.47 ± 116.24 μmoles.h-1.g -1. The same transport system was present in cells grown on galactose and glycerol. Cells grown on 2% (w/v) glucose transport lactose at very low rates. However, when the cells grown on glucose were transferred to 2% (w/v) lactose, the transport exhibited a partial recovery. In addition, the lactose transport is not inactivated by glucose. This recovery does not appear to require protein synthesis since cycloheximide and hygromycin B did not inhibit the partial derepression. The sub-cellular localization of Lac12p is dependent of carbon source and concentration. Consumption of glucose and lactose is simultaneous although glucose retard consumption of lactose. The consumption of lactose is preferred to galactose when both sugars are present. These data allow us to infer that the lactose transport system in K. lactis JA6 is constitutive, and that glucose exerts a control not so clear in the lactose transport. From experiments with Lac12-GFPp, we conclude that glucose control involves transcriptional and posttranscriptional steps.Castro, Ieso de MirandaMoraes, Karen Cristiane Martinez deBorges, William de CastroSantos, Ana Maria dos2016-07-01T13:16:54Z2016-07-01T13:16:54Z2013info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfSANTOS, Ana Maria dos. Regulação do transporte de lactose em Kluyveromyces lactis JA6. 2013. 60 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2013.http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/6554Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 28/06/2016 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFOPinstname:Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)instacron:UFOP2019-09-19T14:08:37Zoai:repositorio.ufop.br:123456789/6554Repositório InstitucionalPUBhttp://www.repositorio.ufop.br/oai/requestrepositorio@ufop.edu.bropendoar:32332019-09-19T14:08:37Repositório Institucional da UFOP - Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)false
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