Padronização e validação da extração de DNA genômico em tecidos parafinados de camundongos e cães infectados com o Trypanosoma cruzi para análise por qPCR.

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Medeiros, Luciana da Fonseca
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFOP
Texto Completo: https://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/18714
Resumo: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
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spelling Padronização e validação da extração de DNA genômico em tecidos parafinados de camundongos e cães infectados com o Trypanosoma cruzi para análise por qPCR.Doença de ChagasTrypanosoma cruziExtração de DNAPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.A doença de Chagas (DCh) causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi é uma doença negligenciada caracterizada por apresentar duas fases distintas de infecção: fase aguda e fase crônica. Dada as dificuldades no diagnóstico precoce da DCh, dentre elas a inespecificidade dos sintomas na fase aguda, o baixo parasitismo na fase crônica, a heterogeneidade genética característica do T. cruzi, a complexidade da infecção e dos mecanismos de evasão da resposta imune, um estudo retrospectivo pode auxiliar tanto em estudos de eficácia terapêutica como em estudos de sequenciamento. Diante disso, o uso de técnicas moleculares aumenta a sensibilidade e a especificidade dos testes inclusive em casos crônicos. Amostras de tecidos fixados em formol e embebidos em parafina (FFPE) já utilizadas em outros estudos além de diagnósticos histopatológicos podem fornecer valiosas informações, além de exibirem uma das melhores e econômicas formas de preservação e armazenamento de material. Ácidos nucleicos extraídos de material em parafina têm sido empregados com sucesso no diagnóstico e estudo de várias infecções causadas por diferentes patógenos. O objetivo deste trabalho foi padronizar e validar uma metodologia para extração de DNA e posterior quantificação da carga parasitária por qPCR de tecidos de camundongos e cães infectados com o T. cruzi, embebidos em parafina. Nossos resultados mostraram que o protocolo padronizado permitiu a extração, amplificação e quantificação do DNA em tecidos parafinados em modelo murino e canino. Cortes com espessuras de 200 μm para o coração e esôfago, e 100 μm para o cólon, fígado de camundongos e cães respectivamente, forneceram DNA em quantidade suficiente para realização das reações de qPCR para detecção do parasito. Não foram observadas diferenças entre as razões de absorbância 260/280 nas amostras preservadas por 3, 5 e 9 anos. Em relação às amostras de cães, foi possível observar que não houve diferença na concentração de DNA obtida nas amostras preservadas por 3 e 9 anos, exceto para as amostras de fígado com 9 anos de preservação. O tempo de preservação parece não ter interferido na extração e quantificação do DNA. Além disso, amostras com maior tempo de preservação apresentaram menor sensibilidade de detecção de DNA em comparação aos outros tempos de preservação. Diante do exposto, podemos concluir que o uso de um kit de extração não convencional para FFPE apresentou qualidade semelhante aos kits específicos para essa finalidade. Nosso protocolo tem potencial para extrair DNA genômico de boa qualidade em amostras com até 9 anos de preservação utilizando um kit de menor custo, podendo ser aplicado à rotina de laboratório.Chagas disease (DCh) caused by the protozoan Trypanosoma cruzi is a neglected disease characterized by two distinct phases of infection: acute phase and chronic phase. Given the difficulties in the early diagnosis of DCh, including the lack of specificity of symptoms in the acute phase, the low parasitism in the chronic phase, the characteristic heterogeneity of T. cruzi, the complexity of the infection and the mechanisms of evasion of the immune response, a retrospective study it can help both in therapeutic efficacy studies and in sequencing studies. Therefore, the use of molecular techniques increases the sensitivity and specificity of the tests, even in chronic cases. Samples of formalin-fixed and paraffin- embedded (FFPE) tissues already used in other studies, in addition to histopathological diagnoses, can provide valuable information, in addition to displaying one of the best and most economical ways to preserve and store material. Nucleic acids extracted from paraffin material have been successfully used in the diagnosis and study of various infections caused by different pathogens. The objective of this work was to standardize and validate a methodology for DNA extraction and subsequent quantification of the parasite load by qPCR of tissue from mice and dogs infected with T. cruzi, embedded in paraffin. Our results showed that the standardized protocol allowed the extraction, amplification, and quantification of DNA in paraffin-embedded tissues in a murine and canine model. Sections with a thickness of 200 μm for the heart and esophagus and 100 μm for the colon, and liver of mice and dogs, respectively, provided DNA in sufficient quantity to perform the qPCR reactions for parasite detection. No differences were observed between the 260/280 absorbance ratios in samples preserved for 3, 5, and 9 years. Regarding the dog samples, it was possible to observe that there was no difference in the DNA concentration obtained in the samples preserved for 3 and 9 years, except for the liver samples with 9 years of preservation. Preservation time does not seem to have interfered with DNA extraction and quantification. Additionally, samples with longer preservation times had lower DNA detection sensitivity compared to other preservation times. Given the above, we can conclude that the use of an unconventional extraction kit for FFPE presented similar quality to specific kits for this purpose. Our protocol has the potential to extract good quality genomic DNA in samples with up to 9 years of preservation using a lower-cost kit and can be applied to the laboratory routine.Carneiro, Cláudia MartinsVieira, Paula Melo de AbreuCarneiro, Cláudia MartinsVieira, Paula Melo de AbreuAssis, Girley Francisco Machado deCosta, Guilherme de PaulaMedeiros, Luciana da Fonseca2024-10-02T18:42:11Z2024-10-02T18:42:11Z2023info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfMEDEIROS, Luciana da Fonseca. Padronização e validação da extração de DNA genômico em tecidos parafinados de camundongos e cães infectados com o Trypanosoma cruzi para análise por qPCR. 2023. 61 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2023.https://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/18714Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United Stateshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 25/05/2023 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que sejam citados o autor e o licenciante. 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