Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO® e expressão da proteína recombinante.

• Autor(a) principal: Batista, Thiago Mafra
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFOP
• Texto Completo: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2698
• topic: Toxinas; Clonagem; Aranha - veneno; Biologia molecular

O estudo de toxinas presentes em venenos de animais vem apresentando crescimento contínuo. O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, popularmente conhecida como caranguejeira, ainda é pouco explorado. Neste trabalho, nós sub clonamos a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-HIS-TOPO® (Invitrogen) em fusão com um V5 epitope e uma cauda de histidina. A LTx5 foi previamente identificada através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp. Após confirmação da clonagem por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição, realizamos o sequenciamento de ambas as fitas do DNA e verificamos que o inserto foi inserido no frame correto. A expressão da proteína recombinante foi realizada utilizando células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A. Alcançamos uma melhor expressão da proteína recombinante LTx5 quando as células foram pré-cultivadas em meio contendo rafinose, e induzidas em meio contendo 4% de galactose (p/v). A imunodetecção da proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina utilizando anticorpo monoclonal anti His-Tag só foi possível em ensaios de Dot Blot. O tratamento no qual as proteínas são submetidas em um ensaio de Western Blot parece interferir na ligação antígenoanticorpo. Não alcançamos sucesso nos procedimentos de purificação testados devido ao baixo rendimento de expressão da proteína. A presença de códons raros na sequencia codificante para a toxina LTx5 e a toxicidade da molécula para as células de Saccharomyces cerevisiae parecem afetar negativamente o rendimento da expressão da proteína. Sugerimos que os estudos futuros com esta toxina sejam realizados utilizando um sistema mais eficiente para a expressão da proteína.