Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cunha, Aureliano Claret da
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFOP
Texto Completo: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10813
Resumo: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
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spelling Cunha, Aureliano Claret daBrandão, Rogélio LopesTótola, Marcos RogérioFreitas, Renata Nascimento deSilva, Silvana de QueirozMendes, Tiago Antônio de OliveiraBrandão, Rogélio LopesSantos, Fernanda GodoyLucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões2019-03-21T15:40:46Z2019-03-21T15:40:46Z2019CUNHA, Aureliano Claret da. Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos. 2019. 124 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2018.http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10813Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.Nos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1, e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.In recent years, the increased production of crude glycerol, a byproduct of biodiesel production, has encouraged the search for alternative glycerol application processes. Among the alternatives, we highlight the biotechnological processes using microbial cell factories to convert glycerol into high-value products with wide industrial use and low environmental impact. The objective of the present work was to characterize Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, a yeast strain capable of efficiently using glycerol as the sole carbon source, by the isolation and characterization of the high affinity glycerol transporter (WaStl1p), and its genome sequencing. Genetic engineering strategies were also used in Saccharomyces cerevisiae BY4741, in order to optimize the consumption of glycerol and obtain its conversion into ethanol. W. anomalus LBCM 1105 showed higher growth rates than S. cerevisiae BY4741 regardless of the medium (YP or YNB) and the carbon source (glucose or glycerol). In order to improve BY4741 performance in glycerol, the simultaneous overexpression of the glycerol active transporter Stl1 and of the first enzyme from glycerol catabolism Gut1, promoting the inwards flux of glycerol was performed. Additionally, the Pdc2p transcription factor/activator which controls the expression of several genes, including PDC1, PDC5 and THI10, was also tempted in order to promote the diverting of the glycolytic flux towards fermentation. The constructions were confirmed by amplification of target fragments and DNA sequencing. The final performance of each mutant was evaluated, but the expected effect was not obtained. Growth rate decreased with the number of genetic manipulations suggesting a proportionate decrease in fitness. In collaboration with the National Laboratory of Bioethanol Science and Technology (CTBE), the genome of LBCM1105 was sequenced, assembled, annotated and subjected to multi loci phylogenetic analyzes. The genome of W. anomalus LBCM1105 shows 12.78 Mb, with GC% of 34.52, 20.5x depth coverage and 90% extension and completeness. Compared with known yeasts, the genome contains all the sequences of proteins related to the transport and metabolism of glycerol. The WaSTL1 gene was isolated by PCR and cloned into the vector (pCev-G2-Km). The mutant S. cerevisiae BY4741 stl1Δ was transformed with the construction. Characterization of the glycerol transport mechanism confirmed (i) that WaStl1p has a high affinity for glycerol, Km = 0.96 ± 0.15 mM, (ii) that in addition to the high affinity the LBCM1105 strain exhibits a high amount of active transporter, Vmax = 148.3 ± 10.16 μmol h-1 g-1, and (iii) that the heterologous expression of the gene in S. cerevisiae stl1Δ complements the mutant. The active character of the transport was confirmed by the sensitivity to the protonionophore carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone, in LBCM1105 and S. cerevisiae BY4741 stl1Δ WaSTL1. Further studies of the metabolic pathways of glycerol in yeasts will be needed to make develop more efficient genetic engineering strategies.Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 18/03/2019 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite a adaptação.info:eu-repo/semantics/openAccessCachaçaBiodieselEtanolBiotecnologia - indústria.Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFOPinstname:Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)instacron:UFOPORIGINALTESE_EstudosConsumoGlicerol.pdfTESE_EstudosConsumoGlicerol.pdfapplication/pdf14506385http://www.repositorio.ufop.br/bitstream/123456789/10813/6/TESE_EstudosConsumoGlicerol.pdf3604b6a825f0ef7ab68e491dcbd3366aMD56LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-8924http://www.repositorio.ufop.br/bitstream/123456789/10813/5/license.txt62604f8d955274beb56c80ce1ee5dcaeMD55CC-LICENSElicense_urllicense_urltext/plain; charset=utf-846http://www.repositorio.ufop.br/bitstream/123456789/10813/2/license_url587cd8ffae15c8598ed3c46d248a3f38MD52license_textlicense_texttext/html; charset=utf-80http://www.repositorio.ufop.br/bitstream/123456789/10813/3/license_textd41d8cd98f00b204e9800998ecf8427eMD53license_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-80http://www.repositorio.ufop.br/bitstream/123456789/10813/4/license_rdfd41d8cd98f00b204e9800998ecf8427eMD54123456789/108132019-03-21 11:50:19.832oai:localhost: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ório InstitucionalPUBhttp://www.repositorio.ufop.br/oai/requestrepositorio@ufop.edu.bropendoar:32332019-03-21T15:50:19Repositório Institucional da UFOP - Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)false
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