Análise genômica e proteômica de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos produtores de biofilme
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Publication Date: | 2021 |
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Source: | Repositório Institucional da UFPE |
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Summary: | A ocorrência de Pseudomonas aeruginosa resistente aos carbapenêmicos (CRPA) tornou-se um sério problema de saúde pública em todo o mundo, pois reduz as opções terapêuticas contra esse microrganismo, além disso, a produção de biofilme por estes microrganismos agrava ainda mais este problema. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de genes de β-lactamases e do quorum sensing (QS) em isolados de CRPA, analisar a produção de biofilme, avaliar a resposta deles frente à monoterapia com meropenem (MPM) ou polimixina B (POL B) e sua associação com azitromicina (AZT) usando pontos quânticos (QDs) e análise proteômica, além da analisar o genoma destes isolados. Seis isolados de CRPA foram analisados neste estudo. A busca dos genes das β- lactamases (blaKPC, blaSPM-1, blaIMP e blaVIM) e QS (lasI, lasR, rhlI e rhlR) foi realizada por meio de PCRs específicas e pesquisa da produção de biofilme por realizada por técnica quantitativa. Um isolado de CRPA, contendo o gene blaKPC e produtor de biofilme, foi selecionado para avaliar sua resposta à terapia usando QDs conjugados a MPM como uma sonda e o MS pela técnica de dessorção a laser assistida por matriz / tempo de voo de ionização (MALDI-TOF) para avaliar a expressão de proteínas. O único gene de β-lactamase detectado foi o blaKPC em 66,7% dos isolados. Todos os isolados foram produtores de biofilme e portadores dos genes do QS. Os conjugados QDs-MPM desencadearam a formação de biofilme pelo isolado e a associação com AZT inibiu esse efeito. A análise proteômica mostrou que os tratamentos com MPM ou POL B suprimiram a expressão da proteína transglicosilase, enquanto a terapia combinada com AZT resultou na expressão da proteína RpoN. O sequenciamento genômico dos isolados foi realizado usando a plataforma Illumina MiSeq. A montagem foi realizada usando o pipeline A5-miseq, e a predição do gene foi determinada usando os pipelines RAST e Prokka. A análise de MLST foi conduzida usando a ferramenta do site http://www.genomicepidemiology.org/. A análise genômica mostrou a presença de um genoma maior no isolado JX03, apresentando 6.136.978 bp, enquanto o isolado JX05 teve um genoma com 5.607.393 bp. O resistoma revelou que os isolados abrigavam o gene blaKPC em um pequeno contig associado com ISKpn6, e ambos tinham genes relacionados à bombas de efluxo, mutações do gene gyrA, genes de porina e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs). A análise de MLST revelou que o isolado JX03 pertence ao tipo clonal ST244, enquanto o JX05 pertence ao ST277, clone epidêmico brasileiro. Além disso, descrevemos neste estudo o primeiro relato de um isolado pertencente ao clone ST277 portador do gene blaKPC sem apresentar o gene blaSPM-1. Assim, este estudo mostra que o uso da fluorescência combinada com a análise proteômica foi promissor para entender como uma cepa de CRPA reage ao tratamento antimicrobiano e também demonstra a disseminação do gene blaKPC no país como um dos principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos. |
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LIMA, Jailton Lobo da Costahttp://lattes.cnpq.br/3383041302463897http://lattes.cnpq.br/3062403698472127http://lattes.cnpq.br/5362501916620143MACIEL, Maria Amélia VieiraXIMENES, Rafael Matos2022-05-02T18:25:06Z2022-05-02T18:25:06Z2021-02-26LIMA, Jailton Lobo da Costa. Análise genômica e proteômica de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos produtores de biofilme. 2021. Tese (Doutorado em Medicina Tropical) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2021.https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/44266A ocorrência de Pseudomonas aeruginosa resistente aos carbapenêmicos (CRPA) tornou-se um sério problema de saúde pública em todo o mundo, pois reduz as opções terapêuticas contra esse microrganismo, além disso, a produção de biofilme por estes microrganismos agrava ainda mais este problema. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de genes de β-lactamases e do quorum sensing (QS) em isolados de CRPA, analisar a produção de biofilme, avaliar a resposta deles frente à monoterapia com meropenem (MPM) ou polimixina B (POL B) e sua associação com azitromicina (AZT) usando pontos quânticos (QDs) e análise proteômica, além da analisar o genoma destes isolados. Seis isolados de CRPA foram analisados neste estudo. A busca dos genes das β- lactamases (blaKPC, blaSPM-1, blaIMP e blaVIM) e QS (lasI, lasR, rhlI e rhlR) foi realizada por meio de PCRs específicas e pesquisa da produção de biofilme por realizada por técnica quantitativa. Um isolado de CRPA, contendo o gene blaKPC e produtor de biofilme, foi selecionado para avaliar sua resposta à terapia usando QDs conjugados a MPM como uma sonda e o MS pela técnica de dessorção a laser assistida por matriz / tempo de voo de ionização (MALDI-TOF) para avaliar a expressão de proteínas. O único gene de β-lactamase detectado foi o blaKPC em 66,7% dos isolados. Todos os isolados foram produtores de biofilme e portadores dos genes do QS. Os conjugados QDs-MPM desencadearam a formação de biofilme pelo isolado e a associação com AZT inibiu esse efeito. A análise proteômica mostrou que os tratamentos com MPM ou POL B suprimiram a expressão da proteína transglicosilase, enquanto a terapia combinada com AZT resultou na expressão da proteína RpoN. O sequenciamento genômico dos isolados foi realizado usando a plataforma Illumina MiSeq. A montagem foi realizada usando o pipeline A5-miseq, e a predição do gene foi determinada usando os pipelines RAST e Prokka. A análise de MLST foi conduzida usando a ferramenta do site http://www.genomicepidemiology.org/. A análise genômica mostrou a presença de um genoma maior no isolado JX03, apresentando 6.136.978 bp, enquanto o isolado JX05 teve um genoma com 5.607.393 bp. O resistoma revelou que os isolados abrigavam o gene blaKPC em um pequeno contig associado com ISKpn6, e ambos tinham genes relacionados à bombas de efluxo, mutações do gene gyrA, genes de porina e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs). A análise de MLST revelou que o isolado JX03 pertence ao tipo clonal ST244, enquanto o JX05 pertence ao ST277, clone epidêmico brasileiro. Além disso, descrevemos neste estudo o primeiro relato de um isolado pertencente ao clone ST277 portador do gene blaKPC sem apresentar o gene blaSPM-1. Assim, este estudo mostra que o uso da fluorescência combinada com a análise proteômica foi promissor para entender como uma cepa de CRPA reage ao tratamento antimicrobiano e também demonstra a disseminação do gene blaKPC no país como um dos principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos.CAPESThe occurrence of Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenems (CRPA) has become a serious public health problem worldwide, as it reduces the therapeutic options against this microorganism, in addition, the production of biofilm by these microorganisms further aggravates this problem. In this context, the present study aimed to evaluate the occurrence of β-lactamases and quorum sensing (QS) genes in CRPA isolates, analyze biofilm production, research their response to meropenem monotherapy (MPM) or polymyxin B (POL B) and its association with azithromycin (AZT) using quantum dots (QDs) and proteomic analysis, in addition to analyzing the genome of these isolates. Six CRPA isolates were analyzed in this study. The search for the genes of β-lactamases (blaKPC, blaSPM-1, blaIMP e blaVIM) and QS (lasI, lasR, rhlI e rhlR) was carried out by means of specific PCRs and research on biofilm production using a quantitative technique. A CRPA isolate, containing the blaKPC gene and biofilm producer, was selected to assess its response to therapy using QDs conjugated to MPM as a probe and the MS by the ion-assisted matrix / flight time laser desorption technique (MALDI -TOF) to evaluate protein expression. The only β-lactamase gene detected was blaKPC in 66.7% of the isolates. All isolates were biofilm producers and carriers of the QS genes. The QDs-MPM conjugates triggered the formation of biofilm by the isolate and the association with AZT inhibited this effect. Proteomic analysis showed that treatments with MPM or POL B suppressed the expression of the transglycosylase protein, while combined therapy with AZT resulted in the expression of the RpoN protein. Genomic sequencing of the isolates was performed using the Illumina MiSeq platform. The assembly was performed using the A5-miseq pipeline, and the gene prediction was determined using the RAST and Prokka pipelines. The MLST analysis was conducted using the tool on the website http://www.genomicepidemiology.org/. Genomic analysis showed the presence of a larger genome in isolate JX03, presenting 6,136,978 bp, while isolate JX05 had a genome with 5,607,393 bp. The resistoma revealed that the isolates harbored the blaKPC gene in a small contig associated with ISKpn6, and both had genes related to efflux pumps, gyrA mutations, porin genes and aminoglycoside-modifying enzymes (AMEs). The MLST analysis revealed that the isolate JX03 belongs to the clonal type ST244, while the JX05 belongs to ST277, a Brazilian epidemic clone. In addition, we describe in this study the first report of an isolate belonging to clone ST277 carrying the blaKPC gene without presenting the blaSPM-1gene. Thus, this study shows that the use of fluorescence combined with proteomic analysis was promising to understand how a CRPA strain reacts to antimicrobial treatment and also demonstrates the dissemination of the blaKPC gene in the country as one of the main mechanisms of resistance to carbapenems.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Medicina TropicalUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/embargoedAccessPseudomonas aeruginosaBiofilmeResistência bacterianaAnálise genômica e proteômica de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos produtores de biofilmeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisdoutoradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPELICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82142https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/44266/3/license.txt6928b9260b07fb2755249a5ca9903395MD53ORIGINALTESE Jailton Lobo da Costa Lima.pdfTESE Jailton Lobo da Costa Lima.pdfapplication/pdf2722681https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/44266/1/TESE%20Jailton%20Lobo%20da%20Costa%20Lima.pdf007fe02aeab61bcd9b82a6ed347f29e2MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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