Caracterização estrutural e avaliação da atividade antimicrobiana da lectina da testa de Punica granatum L.
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Data de Publicação: | 2015 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/15432 |
Resumo: | Frutos da romãzeira (Punica granatum L.) são usados popularmente para tratar infecções causadas por microorganismos. Este trabalho descreve o isolamento da lectina da sarcotesta de P. granatum (PgTeL; P. granatum testa lectin) através de extração de proteínas utilizando NaCl 0,15 M, fracionamento salino utilizando sulfato de amônio (30 % de saturação) e cromatografia em coluna de quitina. A atividade hemaglutinante (AH) foi monitorada ao longo do processo de purificação utilizando eritrócitos de coelho. A massa molecular de PgTeL nativa foi determinada por cromatografia de gel filtração e o perfil eletroforético em condições desnaturantes foi avaliado em gel de poliacrilamida contendo sulfato sódico de dodecila (SDS-PAGE). Os efeitos do pH, temperatura e íons sobre a sua AH foram determinados e a atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos de importância médica foi avaliada através da determinação das concentrações mínima inibitória (CMI), mínima bactericida (CMB) e mínima fungicida (CMF). Ainda, foi avaliado o efeito de PgTeL na capacidade de aderência e invasiva de bactérias em células HeLa. Tratamento do extrato que apresentou HA específica (18,3) da sarcotesta com sulfato de amônio resultou na precipitação de contaminantes proteicos, uma vez que a fração sobrenadante (FS 30%) apresentou maior AH específica (782) que a fração de proteínas precipitadas (13,92). O perfil da cromatografia de FS 30% em coluna de quitina apresentou um único pico proteico adsorvido, que foi eluído com ácido acético 1,0 M e, após diálise, aglutinou eritrócitos, correspondendo a PgTeL (AH específica: 19.430). A massa molecular relativa de PgTeL nativa em cromatografia de gel filtração foi 58 kDa. Em SDS-PAGE, PgTeL apresentou uma única banda polipeptídica de 58 kDa, indicando que sua estrutura não é formada por subunidades unidas por ligações nãocovalentes. A AH de PgTeL foi detectada em valores de pH de 5,0 a 8,0 e foi resistente ao aquecimento até 100°C durante 30 minutos. A AH de PgTeL foi estimulada por Ca2+ (10 mM) e Mg2+ (20 mM). PgTeL foi agente bacteriostático e bactericida contra Aeromonas sp., Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus mutans (valores de CMI variando de 0,27 a 9,0 μg/mL e CMB de 0,27 a 68,4 μg/mL), enquanto apenas inibiu o crescimento de Klebsiella sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis (valores de CMI variando de 16 a 20 μg/mL). PgTeL também inibiu a capacidade de aderência de S. enteritidis (40% de inibição) e a capacidade invasiva de E. coli e S. aureus (59% e 25% de inibição respectivamente) em células HeLa. PgTeL mostrou atividade antifúngica contra espécies de Candida (com CMI variando de 6,25 a 25 μg/mL e CMF variando de 6,25 a 50 μg/mL). Em conclusão, PgTeL é uma lectina ligadora de quitina, termoestável, ativa em ampla faixa de pH e com ação antibacteriana e antifúngica, bem como é capaz de interferir na aderência e capacidade invasiva bacteriana. |
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SILVA, Pollyanna Michelle daPAIVA, Patricia Maria GuedesGOMES, Francis Soares2016-02-25T18:28:06Z2016-02-25T18:28:06Z2015-02-27https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/15432Frutos da romãzeira (Punica granatum L.) são usados popularmente para tratar infecções causadas por microorganismos. Este trabalho descreve o isolamento da lectina da sarcotesta de P. granatum (PgTeL; P. granatum testa lectin) através de extração de proteínas utilizando NaCl 0,15 M, fracionamento salino utilizando sulfato de amônio (30 % de saturação) e cromatografia em coluna de quitina. A atividade hemaglutinante (AH) foi monitorada ao longo do processo de purificação utilizando eritrócitos de coelho. A massa molecular de PgTeL nativa foi determinada por cromatografia de gel filtração e o perfil eletroforético em condições desnaturantes foi avaliado em gel de poliacrilamida contendo sulfato sódico de dodecila (SDS-PAGE). Os efeitos do pH, temperatura e íons sobre a sua AH foram determinados e a atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos de importância médica foi avaliada através da determinação das concentrações mínima inibitória (CMI), mínima bactericida (CMB) e mínima fungicida (CMF). Ainda, foi avaliado o efeito de PgTeL na capacidade de aderência e invasiva de bactérias em células HeLa. Tratamento do extrato que apresentou HA específica (18,3) da sarcotesta com sulfato de amônio resultou na precipitação de contaminantes proteicos, uma vez que a fração sobrenadante (FS 30%) apresentou maior AH específica (782) que a fração de proteínas precipitadas (13,92). O perfil da cromatografia de FS 30% em coluna de quitina apresentou um único pico proteico adsorvido, que foi eluído com ácido acético 1,0 M e, após diálise, aglutinou eritrócitos, correspondendo a PgTeL (AH específica: 19.430). A massa molecular relativa de PgTeL nativa em cromatografia de gel filtração foi 58 kDa. Em SDS-PAGE, PgTeL apresentou uma única banda polipeptídica de 58 kDa, indicando que sua estrutura não é formada por subunidades unidas por ligações nãocovalentes. A AH de PgTeL foi detectada em valores de pH de 5,0 a 8,0 e foi resistente ao aquecimento até 100°C durante 30 minutos. A AH de PgTeL foi estimulada por Ca2+ (10 mM) e Mg2+ (20 mM). PgTeL foi agente bacteriostático e bactericida contra Aeromonas sp., Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus mutans (valores de CMI variando de 0,27 a 9,0 μg/mL e CMB de 0,27 a 68,4 μg/mL), enquanto apenas inibiu o crescimento de Klebsiella sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis (valores de CMI variando de 16 a 20 μg/mL). PgTeL também inibiu a capacidade de aderência de S. enteritidis (40% de inibição) e a capacidade invasiva de E. coli e S. aureus (59% e 25% de inibição respectivamente) em células HeLa. 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The molecular mass of native PgTeL was determined by gel filtration chromatography and the electrophoretic profile under denaturing conditions was evaluated using polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE). The effects of pH, temperature and ions on its HA were determined and the antimicrobial activity against bacteria and fungi with medical importance was evaluated by determination of minimal bactericide (MBC), inhibitory (MIC) and fungicide (MFC) concentrations. In addition, it was evaluated the effect of PgTeL on the adherence and invasive abilities of bacteria on HeLa cells. Treatment of the sarcotesta extract which showed specific HA (18.3) with ammonium sulphate resulted in precipitation of proteic contaminants since the supernatant fraction (SF 30%) showed highest specific HA (782) than the precipitated protein fraction (13.92). Chromatography profile of SF 30% on chitin column showed a single adsorbed protein peak, which was eluted with 1.0 M acetic acid and, after dialysis, agglutinated erythrocytes, corresponding to PgTeL (specific HA: 19.430). The relative molecular mass of native PgTeL on gel filtration chromatography was 58 kDa. In SDS-PAGE, PgTeL appeared as a single polypepetide band with 58 kDa, indicating that its structure is not composed by subunits linked by non-covalent interactions. The HA of PgTeL was detected at pH values from 5.0 to 8.0 and was resistant to heating at 100°C for 30 minutes. The HA of PgTeL was stimulated by Ca2+ (10 mM) and Mg2+ (20 mM). PgTeL was bacteriostatic and bactericide agent against Aeromonas sp., Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens, Staphylococcus saprophyticus and Streptococcus mutans (MIC values ranging from 0.27 to 9.0 μg/mL and MBC from 0.27 to 68.4 μg/mL) while only inhibited the growth of Klebsiella sp., Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis (MIC values ranging from 16 to 20 μg/mL). PgTeL also inhibited the adherence ability of S. enteritidis (40% inhibition) and invasive ability of E. coli and S. aureus (59% and 25% inhibition respectively) on HeLa cells. PgTeL showed antifungal activity against Candida species (MIC values ranging from 6.25 to 25 μg/mL and MFC ranging from 6.25 to 50 μg/mL). In conclusion, PgTeL is a thermostable and chitin-binding lectin, active at a broad pH range, and with antibacterial and antifungal action, as well as is able to interfere with adherence and invasivive abilities of bacteria.porUNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOPrograma de Pos Graduacao em Bioquimica e FisiologiaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessProteínasLectinasPlantas medicinaisCaracterização estrutural e avaliação da atividade antimicrobiana da lectina da testa de Punica granatum L.info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesismestradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPETHUMBNAILDISSERTAÇÃO Pollyanna Michelle da Silva.pdf.jpgDISSERTAÇÃO Pollyanna Michelle da Silva.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1302https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/15432/5/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20Pollyanna%20Michelle%20da%20Silva.pdf.jpgadfd007ba5b4c5c79842c0206d47a7b7MD55ORIGINALDISSERTAÇÃO Pollyanna Michelle da Silva.pdfDISSERTAÇÃO Pollyanna Michelle da Silva.pdfapplication/pdf1543877https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/15432/1/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20Pollyanna%20Michelle%20da%20Silva.pdf1ffd7e0ed02c76fe3fc79d12bf815053MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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