Avaliação IN Vitro de células natural killer, T E de um esferóide dérmico na Leishmaniose cutânea

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: CAVALCANTE, Marton Kaique de Andrade
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPE
Texto Completo: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/55561
Resumo: HERNANDES, Valéria P., também é conhecida em citações bibliográficas por: HERNANDES, Valéria Pereira. SILVA, Rafael de F. e, também é conhecido em citações bibliográficas por: SILVA, Rafael de Freitas e.
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O curso da infecção na LC está estritamente relacionado a resposta imune do hospedeiro. As células natural killer (NK), são conhecidas pela sua capacidade de matar células infectadas, além de serem fortes produtoras de citocinas, como interferon-γ (IFN-γ), auxiliando no recrutamento e ativação de outras células. Os linfócitos T fazem parte da resposta imune adaptativa e são responsáveis pela resposta celular. Embora haja avanços nos estudos in vitro na LC, o mesmo apresenta diversas limitações, como a não semelhança com o ambiente in vivo. Pensando nisso, as culturas 3D tem sido fortemente recomendadas, visto que há uma mimetização da geometria, ambientação e sinalização entre as células. Porém, até o momento, não se tem relatos da utilização desta técnica para estudos na LC. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as células Natural Killer e T em pacientes com lesão ativa da leishmaniose cutânea e desenvolver e testar um modelo de esferóide dérmico murino imunocompetente para estudos com a Leishmania spp. Fizeram parte do estudo trinta pacientes, sendo 23 pacientes AT e 7 pacientes PT. Além disso, tivemos um terceiro grupo composto por indivíduos saudáveis, denominado controle (CT), formado por 17 pessoas. Foram realizados estudos de imunofenotipagem e dosagem de citocinas a partir de sobrenadante de cultura das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Observamos uma menor percentual de células NK e de células NKT duplo- negativas (DN) nos pacientes com lesão ativa, enquanto, as células NKT CD4+ apresentaram um maior percentual nesta população. Não foi observada diferença significativa no percentual dos linfócitos T CD4+, CD8+ e DN. Além disso, observamos uma maior expressão de PD-1, Granzima b, TIGIT e CLTA-4 tanto nas células NK, quanto nos linfócitos T dos pacientes. Também foi observada a produção significativa de IL-2, IL-4. IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF nos pacientes com lesão ativa e após o tratamento, após estimulação com antígeno de L. braziliensis. Nos estudos em 3D, fibroblastos e macrófagos murinos foram cultivados e para a formação dos esferóides, foi utilizada a técnica de magnetização. Os esferóides formados foram avaliados quanto a sua formação/compactação, análises histológicas e avaliação da carga parasitária por meio de qPCR. Observamos sua formação e compactação após 24 horas de cultivo. Além disso, observamos que a proporção 8 fibroblastos: 1 macrófago apresentou melhor compactação e por isso foi escolhida para os demais experimentos. Na avaliação da carga parasitária, foi possível observar que houve infecção do modelo sendo possível detectar kDNA do parasito por meio da qPCR, revelando que o modelo pode ser promissor e utilizado para estudos na interação parasito-hospedeiro. Desse modo, o entendimento da resposta imune e da relação parasito-hospedeiro na LC é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas e vacinais. Além disso, o desenvolvimento de modelos in vitro que se assemelhem aos eventos que ocorrem no in vivo podem contribuir para o entendimento da doença.FACEPECutaneous leishmaniasis (CL) is a public health problem characterized by the appearance of lesions with a nodular-crusted appearance. The course of infection in CL is strictly related to the host's immune response. Natural killer (NK) cells are known for their ability to kill infected cells, as well as being strong producers of cytokines such as interferon-γ (IFN-γ), helping to recruit and activate other cells. T lymphocytes are part of the adaptive immune response and are responsible for the cellular response. Although there have been advances in in vitro studies in CL, they have several limitations, such as not being similar to the in vivo environment. With this perspective, 3D cultures have been strongly recommended, as they mimic the geometry, environment and signaling between cells. However, to date, there have been no reports of this technique being used for LC studies. In view of this, the aim of this study was to evaluate Natural Killer and T cells in patients with active cutaneous leishmaniasis lesions and to develop and test an immunocompetent murine dermal spheroid model for studies with Leishmania spp. Thirty patients took part in the study, 23 of whom were AT patients and 7 PT patients. In addition, we had a third group of healthy individuals, called control (CT), made up of 17 people. Immunophenotyping and cytokine dosage studies were carried out on the culture supernatant of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We observed a lower percentage of NK cells and double-negative (DN) NKT cells in patients with active lesions, while CD4+ NKT cells showed a higher percentage in this population. No significant difference was observed in the percentage of CD4+, CD8+ and DN T lymphocytes. In addition, we observed greater expression of PD-1, Granzyme b, TIGIT and CLTA-4 in both the NK cells and the patients' T lymphocytes. Significant production of IL-2, IL-4. IL-6, IL-10, IL-17, IFN- γ and TNF were also observed in patients with active lesions and after treatment, following stimulation with L. braziliensis antigen. In the 3D studies, murine fibroblasts and macrophages were cultured and the magnetization technique was used to form the spheroids. The spheroids formed were evaluated for their formation/compaction, histological analysis and parasite load assessment using qPCR. We observed their formation and compaction after 24 hours of cultivation. In addition, we observed that the ratio 8 fibroblasts: 1 macrophage showed better compaction and was therefore chosen for the other experiments. When assessing the parasite load, it was possible to observe that the model was infected and it was possible to detect the parasite's kDNA using qPCR, revealing that the model could be promising and used for studies into parasite-host interaction. Thus, understanding the immune response and the parasite-host relationship in CL is essential for developing new prophylactic and vaccine strategies. In addition, the development of in vitro models that resemble the events that occur in vivo can contribute to understanding the disease.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Inovacao TerapeuticaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/embargoedAccessLeishmanioseResposta imuneImunidade celularCultura de celulaModelos tridimensionaisAvaliação IN Vitro de células natural killer, T E de um esferóide dérmico na Leishmaniose cutâneainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisdoutoradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPEORIGINALTESE Marton Kaique de Andrade Cavalcante.pdfTESE Marton Kaique de Andrade Cavalcante.pdfapplication/pdf13386615https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/55561/1/TESE%20Marton%20Kaique%20de%20Andrade%20Cavalcante.pdf5dfa554df09f9e21ca4a97ea88f38801MD51TEXTTESE Marton Kaique de Andrade Cavalcante.pdf.txtTESE Marton Kaique de Andrade Cavalcante.pdf.txtExtracted texttext/plain226909https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/55561/4/TESE%20Marton%20Kaique%20de%20Andrade%20Cavalcante.pdf.txt7bf829299138f630ee05f8912503c249MD54THUMBNAILTESE Marton Kaique de Andrade Cavalcante.pdf.jpgTESE Marton Kaique de Andrade Cavalcante.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1208https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/55561/5/TESE%20Marton%20Kaique%20de%20Andrade%20Cavalcante.pdf.jpg4d865a322a0f1e47b7883c7feb40e022MD55LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; 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