Identificação e purificação das proteínas plasmáticas mediante o emprego de compósitos magnéticos com heparina
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Data de Publicação: | 2020 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/37633 |
Resumo: | Heparina é um glicosaminoglicano de elevada carga negativa que pode ser utilizado como ligante de afinidade ou trocador iônico para purificação, identificação e depleção de proteínas. Por apresentar grupos funcionais reativos, a heparina, se torna bastante atrativa para os estudos em imobilização de biomoléculas. No presente estudo, foram sintetizadas e caracterizadas três diferentes partículas magnéticas: Dacron(polietilenotereftalato)-hidrazida magnético (mDAC), quitosana magnética (QS-MAG) e magnetita revestida com polianilina (MAG-PANI). Essas partículas foram magnetizadas a partir do método da co-precipitação de cloreto férrico e ferroso em meio aquoso e alcalino. Esses materiais serviram como suporte para imobilização covalente da heparina mediante a formação de uma ligação amida entre os grupamentos amina presentes nas partículas magnéticas com os grupos carboxílicos da heparina funcionalizados com carbodiimida (EDAC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). A morfologia e distribuição das partículas foram analisadas por microscopia eletrônica (varredura e transmissão) e indicaram que mDAC, QS-MAG e MAG-PANI apresentaram um tamanho de 1-2 μm, 100-300 μm e 12 nm, respectivamente. Foram realizadas análises por difração de raio-X para evidenciar a presença da magnetita (Fe3O4) e dos polímeros (polietilenotereftalato, quitosana de baixo peso molecular e polianilina) nas diferentes partículas sintetizadas. Para finalizar a caracterização física dos materiais, medidas de magnetização foram realizadas, e todas as partículas sintetizadas demonstraram um comportamento superparamagnético. A saturação magnética (Ms) para mDAC, QS-MAG e MAG-PANI heparina foram 23, 15 e 68 emu/g, respectivamente, nas temperaturas de 293 K, 300 K e 313 K. A quantidade de heparina imobilizada em mDAC, QS-MAG e MAG-PANI foi, respectivamente, 51 ± 0,1; 93,8 ± 1,93 e 43 ± 6,2 μg de heparina por mg de cada suporte. Na etapa de purificação/separação das proteínas plasmáticas, diferentes volumes de plasma humano total e diluído foram incubados com as partículas de mDAC e QS-MAG com heparina imobilizada covalentemente. A eluição das proteínas foi realizada com concentrações crescentes de NaCl entre 0,15 e 2,0 M em tampão fosfato 10 mM pH 7,4 ou tampão fosfato 10 mM pH 5,5 ou tampão Tris-HCL 50 mM pH 8,5. As nanopartículas de MAG-PANI com heparina imobilizada covalentemente foram utilizadas para avaliar a interação/afinidade com enzimas plasmáticas humanas específicas: trombina e Fator Xa. As proteínas que foram eluídas após incubação do plasma humano com a heparina imobilizada nas partículas magnéticas foram investigadas por eletroforese SDS/PAGE e/ou separadas por gel-filtração (Superdex G75 - AKTA Purifier) e/ou sequenciadas por LC/MS. Ensaios de atividade biológica das proteínas purificadas foram analisadas pelo TP, TTPa e teste de inibição da trombina (cromogênico) e revelaram a presença de inibidores da família das serpinas, como por exemplo a antitrombina, que foram separados/purificados. Além disso, proteínas como albumina humana, protrombina, trombina e Fator Xa apresentaram afinidade à heparina imobilizada nas partículas magnéticas, o que garante a utilização dessa ferramenta como uma alternativa fácil e de baixo custo para a purificação e identificação dessas proteínas. |
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No presente estudo, foram sintetizadas e caracterizadas três diferentes partículas magnéticas: Dacron(polietilenotereftalato)-hidrazida magnético (mDAC), quitosana magnética (QS-MAG) e magnetita revestida com polianilina (MAG-PANI). Essas partículas foram magnetizadas a partir do método da co-precipitação de cloreto férrico e ferroso em meio aquoso e alcalino. Esses materiais serviram como suporte para imobilização covalente da heparina mediante a formação de uma ligação amida entre os grupamentos amina presentes nas partículas magnéticas com os grupos carboxílicos da heparina funcionalizados com carbodiimida (EDAC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). A morfologia e distribuição das partículas foram analisadas por microscopia eletrônica (varredura e transmissão) e indicaram que mDAC, QS-MAG e MAG-PANI apresentaram um tamanho de 1-2 μm, 100-300 μm e 12 nm, respectivamente. Foram realizadas análises por difração de raio-X para evidenciar a presença da magnetita (Fe3O4) e dos polímeros (polietilenotereftalato, quitosana de baixo peso molecular e polianilina) nas diferentes partículas sintetizadas. Para finalizar a caracterização física dos materiais, medidas de magnetização foram realizadas, e todas as partículas sintetizadas demonstraram um comportamento superparamagnético. A saturação magnética (Ms) para mDAC, QS-MAG e MAG-PANI heparina foram 23, 15 e 68 emu/g, respectivamente, nas temperaturas de 293 K, 300 K e 313 K. A quantidade de heparina imobilizada em mDAC, QS-MAG e MAG-PANI foi, respectivamente, 51 ± 0,1; 93,8 ± 1,93 e 43 ± 6,2 μg de heparina por mg de cada suporte. Na etapa de purificação/separação das proteínas plasmáticas, diferentes volumes de plasma humano total e diluído foram incubados com as partículas de mDAC e QS-MAG com heparina imobilizada covalentemente. 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Além disso, proteínas como albumina humana, protrombina, trombina e Fator Xa apresentaram afinidade à heparina imobilizada nas partículas magnéticas, o que garante a utilização dessa ferramenta como uma alternativa fácil e de baixo custo para a purificação e identificação dessas proteínas.FACEPEHeparin is a high negative charge glycosaminoglycan that can be used as an affinity ligand or ion exchange for protein purification, identification and depletion. Heparin contains has reactive functional groups that are very attractive for studies in immobilization of biomolecules. In the present study, three different magnetic particles were synthesized and characterized: Dacron (polyethylene terephthalate)-hydrazide (mDAC), magnetic chitosan (MAG-CH) and magnetite coated with polyaniline (MAG-PANI). These particles were magnetized from the co-precipitation method of ferric and ferrous chloride in aqueous and alkaline media. These materials served as a support for immobilization of heparin, which was covalently attached through by the amine groups present in the composites and the carboxylic groups of heparin functionalized with carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The morphology and distribution of the particles were analyzed by electron microscopy (sccaning and transmition), so mDAC, MAG-CH and MAG-PANI presented sizes of 1-2 μm, 100-300 μm and 12 nm, respectively. X-ray diffraction analysis was performed to show the presence of magnetite (Fe3O4) and polymers (polyethylene terephthalate, low molecular weight chitosan and polyaniline) in the different synthesized particles. All magnetization measurements were performed, and the synthesized particles showed a superparamagnetic behavior. Magnetic saturation (Ms) for mDAC, MAG-CH and MAG-PANI was 23, 15 and 68 emu/g, respectively, at 293 K, 300 K and 313 K. The amount of immobilized heparin in mDAC, MAG-CH and MAG-PANI was, respectively, 51 ± 0.1; 93.8 ± 1.93 and 43 ± 6.2 μg of heparin per mg of each support. The plasma protein purification/separation steps, different volumes of total and diluted human plasma were incubated with mDAC and MAG-CH particles containing covalently immobilized heparin. Elution of the proteins were performed with increasing concentrations of NaCl (0.15-2.0 M) in 10 mM phosphate buffered saline pH 7.4 or 10 mM phosphate buffer pH 5.5 or 50 mM Tris-HCL buffer pH 8.5. MAG-PANI nanoparticles with covalently immobilized heparin were used to evaluate the interaction/affinity with specific human plasma enzymes: thrombin and Factor Xa. Proteins that were eluted after incubation of the human plasma with the heparin immobilized on the magnetic particles were investigated by SDS/PAGE electrophoresis or gel-filtration separated (Superdex G75 - AKTA Purifier) or sequenced by LC/MS. Biological activity assays of the purified proteins were analyzed by TP, TTPa and thrombin inhibition test (chromogenic) and revealed the presence of inhibitors of the serpin family, such as antithrombin, which were separated/purified. In addition, proteins such human albumin, prothrombin, thrombin and Factor Xa showed affinity for heparin immobilized on magnetic particles. Therefore these materials can be used as an easy and inexpensive alternative tool for the purification and identification of these proteins.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Biologia Aplicada a SaudeUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/embargoedAccessProteínasHeparinaPartículas magnéticasIdentificação e purificação das proteínas plasmáticas mediante o emprego de compósitos magnéticos com heparinainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisdoutoradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPELICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82310https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/37633/3/license.txtbd573a5ca8288eb7272482765f819534MD53ORIGINALTESE Aurenice Arruda Dutra das Merces.pdfTESE Aurenice Arruda Dutra das Merces.pdfapplication/pdf12776135https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/37633/1/TESE%20Aurenice%20Arruda%20Dutra%20das%20Merces.pdf641c5d65faf831af21680da534c87f54MD51TEXTTESE Aurenice Arruda Dutra das Merces.pdf.txtTESE Aurenice Arruda Dutra das Merces.pdf.txtExtracted texttext/plain405338https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/37633/4/TESE%20Aurenice%20Arruda%20Dutra%20das%20Merces.pdf.txte1c7ed0d6c7668b073731bcf187f9ec9MD54THUMBNAILTESE Aurenice Arruda Dutra das Merces.pdf.jpgTESE Aurenice Arruda Dutra das Merces.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1191https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/37633/5/TESE%20Aurenice%20Arruda%20Dutra%20das%20Merces.pdf.jpg50c222c07b18c27582f11d901c56c8fdMD55CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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