Purificação, caracterização e utilização de protease de Mytella charruana (Bivalvia: Mytilidae) na obtenção de peptídeos antimicrobianos
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Data de Publicação: | 2017 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/30719 |
Resumo: | Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de maneira seletiva, o que resulta na degradação de proteínas. Essas enzimas são amplamente utilizadas na indústria nas indústrias química, farmacêutica e de alimentos, por exemplo, por apresentarem diversas aplicações biotecnológicas. Na sua estrutura nativa, proteínas de reserva geralmente não apresentam nenhuma atividade antimicrobiana, mas quando degradadas por proteases podem liberar peptídeos bioativos com ação antimicrobiana. Os objetivos da presente dissertação foram purificar e caracterizar uma protease a partir da massa visceral do mexilhão Mytella charruana (denominada MycP, do inglês M. charruana protease) e avaliar sua capacidade de hidrolisar caseína de leite e gerar peptídeos antimicrobianos. A massa visceral de M. charruana foi homogeneizada com Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e, após centrifugação, o extrato foi avaliado quanto à atividade proteolítica total. O efeito de inibidores de protease foi avaliado. MycP foi isolada através de cromatografia de gel filtração (Sephadex G-75) seguida de cromatografia de troca iônica (DEAE-Sephadex A25). A protease foi submetida à focalização isoelétrica e SDS-PAGE e avaliada quanto à atividade tripsina-símile. O efeito do pH e temperatura na atividade tripsina-símile foi determinado. MycP foi utilizada para realizar a hidrólise da caseína e o hidrolisado foi avaliado quanto à atividade antibacteriana contra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae e Micrococcus luteus, e atividade antifúngica contra Candida albicans, Candida tropicalis e Candida krusei. O extrato da massa visceral teve sua atividade proteolítica inibida em 55%, 59% e 24%, respectivamente, indicando a presença de aspártico, serino e metalo proteases. MycP apresentou pI 4,1 e uma única banda polipeptídica de 83,1 kDa em SDS-PAGE. MycP apresentou atividade semelhante à tripsina com temperatura ótima de 40ºC. Esta atividade foi estável numa ampla gama de pH (3,0-9,0). O Km relativo à atividade tripsina-símile de MycP foi 4,28±0,34 mM de BApNA e a Vmáx foi 0,056 ± 0,001 nmol de BApNA/min. MycP foi capaz de promover a hidrólise de caseína e o hidrolisado foi capaz de inibir o crescimento de Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis e Klebsiella pneumoniae com MIC de 5,0 μg/mL para todas essas bactérias. Não foi detectada atividade antifúngica contra as espécies de Candida testadas. Em conclusão, a massa visceral de M. charruana contém uma protease com atividade tripsina-símile capaz de gerar peptídeos com efeito bacteriostático derivados da hidrólise da caseína. |
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DORNELLES, Leonardo Prezzihttp://lattes.cnpq.br/2743429238503428http://lattes.cnpq.br/0869167120016962NAPOLEÃO, Thiago HenriquePAIVA, Patrícia Maria Guedes2019-05-14T22:16:27Z2019-05-14T22:16:27Z2017-02-17https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/30719Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de maneira seletiva, o que resulta na degradação de proteínas. Essas enzimas são amplamente utilizadas na indústria nas indústrias química, farmacêutica e de alimentos, por exemplo, por apresentarem diversas aplicações biotecnológicas. Na sua estrutura nativa, proteínas de reserva geralmente não apresentam nenhuma atividade antimicrobiana, mas quando degradadas por proteases podem liberar peptídeos bioativos com ação antimicrobiana. Os objetivos da presente dissertação foram purificar e caracterizar uma protease a partir da massa visceral do mexilhão Mytella charruana (denominada MycP, do inglês M. charruana protease) e avaliar sua capacidade de hidrolisar caseína de leite e gerar peptídeos antimicrobianos. A massa visceral de M. charruana foi homogeneizada com Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e, após centrifugação, o extrato foi avaliado quanto à atividade proteolítica total. O efeito de inibidores de protease foi avaliado. MycP foi isolada através de cromatografia de gel filtração (Sephadex G-75) seguida de cromatografia de troca iônica (DEAE-Sephadex A25). A protease foi submetida à focalização isoelétrica e SDS-PAGE e avaliada quanto à atividade tripsina-símile. O efeito do pH e temperatura na atividade tripsina-símile foi determinado. MycP foi utilizada para realizar a hidrólise da caseína e o hidrolisado foi avaliado quanto à atividade antibacteriana contra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae e Micrococcus luteus, e atividade antifúngica contra Candida albicans, Candida tropicalis e Candida krusei. O extrato da massa visceral teve sua atividade proteolítica inibida em 55%, 59% e 24%, respectivamente, indicando a presença de aspártico, serino e metalo proteases. MycP apresentou pI 4,1 e uma única banda polipeptídica de 83,1 kDa em SDS-PAGE. MycP apresentou atividade semelhante à tripsina com temperatura ótima de 40ºC. Esta atividade foi estável numa ampla gama de pH (3,0-9,0). O Km relativo à atividade tripsina-símile de MycP foi 4,28±0,34 mM de BApNA e a Vmáx foi 0,056 ± 0,001 nmol de BApNA/min. MycP foi capaz de promover a hidrólise de caseína e o hidrolisado foi capaz de inibir o crescimento de Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis e Klebsiella pneumoniae com MIC de 5,0 μg/mL para todas essas bactérias. Não foi detectada atividade antifúngica contra as espécies de Candida testadas. Em conclusão, a massa visceral de M. charruana contém uma protease com atividade tripsina-símile capaz de gerar peptídeos com efeito bacteriostático derivados da hidrólise da caseína.CNPqProteases are enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds in a selective way, which results in protein degradation. These enzymes are broadly used in chemical, pharmaceutical and food industries, for example, due to their several biotechnological applications. Storage proteins are produced by many organisms and their main function is the storage of amino acids that will be used during the embrionary development and growth. In their native structure, these proteins usually do not show any antimicrobial activity, but when degraded, they may release bioactive peptides with antimicrobial action. The aims of this work were to isolate and characterize a protease from the visceral mass of the mussel Mytella charruana (deemed MycP, M. charruana protease) and to evaluate its ability to hydrolyze milk casein and generate antimicrobial peptides. The M. charruana visceral mass was homogenized with 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 and, after centrifugation, the extract was evaluated for total protease activity. The effects of protease inhibitors was evaluated. MycP was isolated through gel filtration chromatography (Sephadex G-75) and ion exchange chromatography (DEAESephadex A25). This protease was submitted to isoelectric focusing and SDS-PAGE as well as evaluated for trypsin-like activity. The effect of pH and temperature on trypsin-like activity was determined. MycP was used to hydrolyze casein and the hydrolysate was evaluated for antibacterial activity against Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae and Micrococcus luteus, and antifungal activity against Candida albicans, Candida tropicalis and Candida krusei. The extract from visceral mass had its protease activity inhibited in 55%, 59% and 24%, respectively, indicating the presence of aspartyl, serine and metalo proteases. MycP showed a single polypeptide band of 83.1 kDa in SDS-PAGE. MycP showed trypsinlike activity with optimal temperature of 40ºC. This activity was stable in a wide pH range (3.0–9.0). The Km regarding trypsin-like activity was 4.28±0.34 mM of BApNA and the Vmax was 0.056±0.001 nmol BApNA/min. MycP was able to promote the hydrolysis of casein and the hydrolysate was able to inhibit the growth of Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis and Klebsiella pneumoniae with MIC of 5.0 μg/mL for all bacteria. Antifungal activity against the tested Candida species was not detected. In conclusion, the visceral mass of M. charruana contains a trypsin-like protease that is able to generate peptides from casein, which showed bacteriostatic effect.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Bioquimica e FisiologiaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessEnzimas proteolíticasBivalve (molusco)PeptídeosPurificação, caracterização e utilização de protease de Mytella charruana (Bivalvia: Mytilidae) na obtenção de peptídeos antimicrobianosinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesismestradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPETHUMBNAILDISSERTAÇÃO Leonardo Prezzi Dornelles.pdf.jpgDISSERTAÇÃO Leonardo Prezzi Dornelles.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1245https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/30719/5/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20Leonardo%20Prezzi%20Dornelles.pdf.jpg97ccc94bb94afc2471e687800160b68fMD55ORIGINALDISSERTAÇÃO Leonardo Prezzi Dornelles.pdfDISSERTAÇÃO Leonardo Prezzi Dornelles.pdfapplication/pdf5382307https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/30719/1/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20Leonardo%20Prezzi%20Dornelles.pdf5587dccdb9ed5a7024458db9fe2e9654MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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