Avaliação e otimização de metodologia turbidimétrica para quantificação de heparina de baixo peso molecular utilizando planejamento de experimentos

• Autor(a) principal: MESQUITA, Anna Carolina Teixeira
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFPE
• Texto Completo: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/27024
• topic: Heparina; Anticoagulantes (Medicina); Trombose

Dentre os métodos para quantificação de heparinas têm se que o método turbidimétrico utiliza as condições de 37 ºC, pH reacional de 4,4 e tempo de reação de 1hora. Através da ferramenta estatística de planejamento de experimentos uma nova condição reacional foi obtida, garantindo o conhecimento da influência de cada fator sobre a metodologia. No comprimento de 500nm foi realizado um planejamento fatorial com ponto central 2³. Em seguida foi realizada a expansão deste planejamento com a adição dos níveis axiais com o objetivo de obtenção da superfície ótima do estudo das variáveis investigadas neste trabalho. Na literatura, é possível também encontrar a utilização de um comprimento de onda menor (290nm) para quantificação de complexos contendo concentrações menores de HBPM. Assim como em 500nm, também foi realizado um estudo de avaliação da influência destes fatores para o comprimento de onda de 290nm, cuja abordagem foi através do planejamento fatorial com ponto central 2³ e em seguida um 2². Os modelos construídos revelaram que mais de metade das variações (> 60%) puderam ser explicadas pelas variáveis investigadas nestes planejamentos em 500nm e 290nm. Então foram determinadas as novas condições para leituras obtidas em 500nm, sendo a temperatura em 37 ºC, pH reacional de 5,4 e tempo de reação em 45minutos. E para 290nm foram estabelecidas as condições experimentais de temperatura em 37ºC, pH reacional de 5,4 e o tempo de reação de 20minutos. Sobre a influência destes parâmetros na resposta do método foi comprovado que a temperatura reacional do meio, tanto para as respostas em 500nm, como em 290nm, não modifica a resposta. No entanto, o pH reacional para as leituras em 500nm produzem modificações consistentes no desempenho do método. O tempo de reação foi um ponto importante avaliado por este trabalho para ambos comprimentos de onda. Houve uma compreensão deste parâmetro frente as concentrações de HBPM que antes não tinha sido relatada em outro trabalho científico. Assim o tempo de reação para 500nm pôde ser modificado para 45minutos. E para 290nm para 20minutos. Após esta etapa de planejamento de experimentos, o método turbidimétrico foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pelos guias do ICH para validação de procedimentos analíticos para a quantificação de diferentes concentrações de HBPM. A realização do estudo da curva de calibração demonstrou que o limite de quantificação para o comprimento de 500nm, com precisão e exatidão, foi até 20μg/mL. Sendo assim, a faixa de linearidade para o comprimento de 500nm foi de 20 – 200μg/mL e devido à presença de heterocedasticidade dos dados a equação de regressão obtida pelo método dos mínimos quadrados ponderados foi y = -0,03421 + 0,00340C. Já para o comprimento de 290nm a faixa de linearidade foi de 3 - 20μg/mL e a equação da regressão obtida pelo método dos mínimos quadrados ordinários foi y = -0,00921 + 0,00583C. A partir da aprovação do método para os demais parâmetros da validação o método foi robusto para variações de temperatura, preciso e exato para ambos comprimentos de onda.