Potencial biotecnológico de Microgramma vacciniifolia : purificação de proteases do rizoma e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina da fronde
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Data de Publicação: | 2020 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/46105 |
Resumo: | As proteases são enzimas que catalisam seletivamente a hidrólise de ligações peptídicas e são responsáveis por quase 60% do mercado de enzimas industriais, com aplicação nas indústrias de detergentes, de couro, farmacêutica, biotecnológica e de alimentos. Já as lectinas são proteínas que possuem pelo menos um domínio não catalítico de ligação reversível a carboidratos específicos, apresentando diversas atividades biológicas. Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae) é uma planta epífita que possui propriedades medicinais, por exemplo, no tratamento de infecções respiratórias. Uma lectina (MvFL) foi previamente purificada da fronde e atividade proteolítica foi detectada em extrato do rizoma dessa planta. Este trabalho descreve a obtenção e caracterização de uma preparação de rizoma de M. vaccinifolia contendo proteases a partir do rizoma de M. vaccinifolia, bem como a avaliação do potencial antifúngico e antibiofilme de MvFL contra Candida. Proteínas do rizoma foram extraídas em tampão Tris e atividade proteolítica foi determinada usando azocaseína como substrato. O extrato foi então cromatografado em coluna de DEAE-Sephadex e o pico (P2) de proteínas adsorvidas foi avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em condições nativas ou desnaturantes. A atividade proteolítica de P2 foi caracterizada quanto ao pH ótimo e à temperatura ótima, natureza química do sítio catalítico (utilizando inibidores específicos), atividade tripsina-símile e cinética em função do aumento da concentração do substrato. Também foi avaliada a atividade coagulante de leite de P2. Extrato e P2 apresentaram atividade proteolítica de 60 e 50 U/mg, respectivamente. Nenhuma banda polipeptídica foi detectada em P2 por PAGE para proteínas básicas, porém duas bandas foram observadas em PAGE para proteínas ácidas, confirmando a presença de duas proteínas. PAGE em condições desnaturantes revelou duas bandas polipeptídicas, de 24,2 e 32,6 kDa. P2 apresentou maior atividade proteolítica em pH 3,0 (104,97 U/mg) e a 80–90 oC. A avaliação do efeito de inibidores revelou a presença de serinoproteases, cisteínoproteases e metaloproteases. P2 apresentou atividade tripsina-símile sendo determinada uma constante de Michaelis (Km) de 2,359 mM de BApNA e velocidade máxima de 0,02413 mmol BApNA/min. P2 não apresentou atividade coagulante de leite. MvFL foi isolada seguindo procedimento previamente estabelecido e apresentou ação fungistática para C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis e C. parapsilosis com valores de concentração mínima inibitória (CMI) de 20, 0,625, 1,25, 40 e 40 μg/mL, respectivamente. Foram investigados então os efeitos de MvFL sobre o potencial de membrana mitocondrial, integridade lisossomal e proliferação de células de C. glabrata usando citometria de fluxo. Por fim, foram avaliados o potencial de sinergismo junto ao fluconazol e a atividade antibiofilme de MvFL contra todos os isolados. MvFL causou despolarização da membrana mitocondrial, rompimento lisossomal e redução da proliferação em C. glabrata, bem como reduziu a proliferação celular. MvFL foi apenas capaz de reduzir levemente a formação de biofilme por C. tropicalis. A combinação fluconazol-MvFL mostrou efeito sinérgico contra C. parapsilosis, aditivo contra C. krusei e C. tropicalis e antagônico contra C. albicans e C. glabrata. Em conclusão, rizoma e fronde de M. vacciniifolia são fontes de proteínas com promissor potencial biotecnológico. |
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Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae) is an epiphytic plant that has medicinal properties, for example, in the treatment of respiratory infections. A lectin was previously purified from the frond (MvFL) and proteolytic activity was detected in the rhizome extract of this plant. This work describes the obtaining and characterization of a preparation from the rhizome of M. vaccinifolia containing proteases, as well as the evaluation of the antifungal and antibiofilm potential of MvFL against Candida. Rhizome proteins were extracted in Tris buffer and proteolytic activity was determined using azocasein as a substrate. The extract was then chromatographed on a DEAE-Sephadex column and the peak (P2) of adsorbed proteins was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under native or denaturing conditions. The proteolytic activity of P2 was characterized in terms of optimum pH and optimum temperature, chemical nature of catalytic site (using specific inhibitors), trypsin-like activity and kinetics as a function of increase in substrate concentration. Milk-clotting activity of P2 was also evaluated. Extract and P2 showed proteolytic activity of 60 and 50 U/mg, respectively. No polypeptide band was detected in P2 by PAGE for basic proteins, however two bands were observed in PAGE for acidic proteins. PAGE under denaturing conditions revealed two polypeptide bands, 24.2 and 32.6 kDa, confirming the presence of two proteins. P2 showed higher proteolytic activity at pH 3.0 (104.97 U/mg) and at 80–90 oC. The evaluation of the effect of inhibitors revealed the presence of serinoproteases, cysteine proteases and metalloproteases. P2 showed trypsin-like activity and a Michaelis constant (Km) of 2.359 mM BApNA was determined and a maximum velocity of 0.02413 mmol BApNA/min. P2 did not show milk-clotting activity. MvFL was isolated following a previously established procedure and presented fungistatic action for C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis and C. parapsilosis with minimum inhibitory concentration (MIC) values of 20, 0.625, 1.25, 40 and 40 μg/mL, respectively. The effects of MvFL on mitochondrial membrane potential, lysosomal integrity and proliferation of C. glabrata cells were then investigated using flow cytometry. Finally, the potential for synergism with fluconazole and the antibiofilm activity of MvFL against all isolates were evaluated. MvFL caused depolarization of the mitochondrial membrane, lysosomal disruption and reduced proliferation in C. glabrata, as well as reduced cell proliferation. MvFL was only able to slightly reduce the biofilm formation by C. tropicalis. The fluconazole-MvFL combination showed a synergistic effect against C. parapsilosis, an additive against C. krusei and C. tropicalis and antagonistic against C. albicans and C. glabrata. In conclusion, the rhizome and frond of M. vacciniifolia are sources of proteins with promising biotechnological potential.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Bioquimica e FisiologiaUFPEBrasilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/embargoedAccessEnzimas de fungosAgentes anti-infecciososLectinaPotencial biotecnológico de Microgramma vacciniifolia : purificação de proteases do rizoma e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina da frondeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesismestradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPEORIGINALDISSERTAÇÃO Rayanne Maria Vitória Vasconcelos de Oliveira.pdfDISSERTAÇÃO Rayanne Maria Vitória Vasconcelos de Oliveira.pdfapplication/pdf1754194https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/46105/1/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20Rayanne%20Maria%20Vit%c3%b3ria%20Vasconcelos%20de%20Oliveira.pdf93f8c4d8d874491837145de360449a97MD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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