Investigação da ecto-5’nucleotidase/cd73 como alvo terapêutico em gliomas

• Autor(a) principal: Teixeira, Fernanda Cardoso
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFPel - Guaiaca
• Texto Completo: http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/handle/prefix/10322
• topic: CIENCIAS BIOLOGICAS; Bioquímica; BIOQUIMICA

Os gliomas são tumores que apresentam características fenotípicas e gênicas de células da glia. A ecto5’nucleotidase/CD73 (5’-NT/CD73) é considerada enzima marca-passo do sistema purinérgico responsável pela hidrólise de AMP em adenosina e apresenta expressão aumentada em tumores sólidos. Estudos de silenciamento da expressão gênica utilizando a ferramenta de RNA de interferência (siRNA) têm sido propostos como novas alternativas terapêuticas. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de inibidores da atividade enzimática e da expressão da 5’-NT/CD73 como alvo terapêutico em gliomas. Para avaliar o efeito do inibidor AMPCP (adenosina 5′-(α,β-metileno) difosfato) sobre a proliferação celular foi utilizado o método de contagem celular e para determinar a hidrólise de AMP em células C6 foi utilizado o método do verde de malaquita. Para a realização do silenciamento da expressão gênica, duas sequências de RNA de interferência inéditas para a 5’-NT/CD73 foram desenhadas e nanoemulsões (NE) foram utilizadas como carreadoras. A citotoxidade da NE em cultura primária de astrócitos e em linhagem celular de glioma C6 foi determinada pelo método do MTT. Para caracterizar as propriedades físico-químicas do complexo formado pela NE e siRNA-CD73 foram analisados parâmetros de tamanho de partícula, potencial zeta e índice de polidispersão utilizando o aparelho Zetasizer e imagens da complexação entre NE e siRNA foram captadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A eficiência do silenciamento promovida pela transfecção dos complexos NE-siRNA-CD73 em glioma C6 foi determinada pela avaliação da atividade AMPásica e pela análise da expressão da 5’-NT/CD73 por imunocitoquímica e por citometria de fluxo utilizando anticorpo específico. A avaliação do efeito antiproliferativo dos complexos NEsiRNA-CD73 em glioma C6 foi realizada por MTT. Os resultados obtidos nessa dissertação estão de acordo com a hipótese do trabalho, onde o AMPCP reduziu a proliferação celular de glioma C6 a qual foi acompanhada pela inibição da hidrólise de AMP. As sequências de siRNA-CD73 foram eficientes em promover o silenciamento da 5’NT/CD73 e a formulação da NE também mostrou boa capacidade de complexação com os oligonucleotídeos, apresentando baixa toxicidade em células normais e seletividade para células tumorais. Observou-se que o complexo NE-siRNA-CD73 foi eficaz para silenciar a enzima e para reduzir a atividade AMPase e a viabilidade glioma C6. É importante notar que o sistema nanoestruturado (NE) foi eficaz tanto em complexar com oligonucleotídos como para entrega-los nas células-alvo. No entanto, existe uma necessidade de novos estudos para compreender o efeito do tratamento do complexo NE-CD73-siRNA sobre o crescimento do tumor in vivo. Por fim, os nossos dados indicam a primeira vez que o potencial de siRNA-CD73 nanoemulsão carregada como uma alternativa terapêutica para o tratamento de GBM. Apesar disso há necessidade de estudos adicionais para compreender o efeito do tratamento dos complexos NE-siRNA-CD73 sobre o crescimento tumoral in vivo.