Genes do metabolismo de nitrato em Herbaspirillum Seropedicae : regulação transcricional em análise funcional

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bonato, Paloma
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/32230
Resumo: Orientadora : Profa. Dra. Liu Un Rigo
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spelling Bonato, PalomaWassem, RoseliUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Rigo, Liu Un2018-10-08T17:01:29Z2018-10-08T17:01:29Z2012https://hdl.handle.net/1884/32230Orientadora : Profa. Dra. Liu Un RigoCo-orientadora : Profa. Dra. Roseli WassemDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/02/2012Bibliografia: fls. 94-101Resumo: Herbaspirillum seropedicae, membro do grupo ?-proteobactérias, é uma bactéria fixadora de nitrogênio e endofítica que se associa com gramíneas de interesse comercial. Além de apresentar genes envolvidos com a fixação de nitrogênio, este microrganismo também apresenta vários genes envolvidos com o metabolismo de nitrato. Entre estes últimos, estão os genes que codificam para prováveis nitrato redutase assimilatória (nasA e Hsero_2899) e nitrato redutase respiratória (narGHJI). Entretanto, o papel desta última enzima em H. seropedicae não é conhecido, uma vez que este microrganismo não é capaz de crescer em anaerobiose utilizando nitrato como fonte única de nitrogênio. Além de conter genes que codificam para prováveis nitrato redutases, H. seropedicae também contém genes que codificam para prováveis transportadores de nitrato (narK, narK1U e nasFED) e proteínas regulatórias (nasR e narXL). A regulação transcricional de vários destes genes já foi estudada anteriormente, no entanto, ela ainda não é completamente entendida. Desse modo, com o intuito de melhor compreender a regulação de genes envolvidos com o metabolismo de nitrato em H. seropedicae e entender quais são os papéis das nitrato redutases deste microrganismo, neste trabalho foram utilizadas três abordagens. Primeiramente, RNA total a partir de H. seropedicae estirpe SmR1 crescido em nitrato como fonte única de nitrogênio foi extraído, depletado de rRNA e usado para análise transcricional através de RNAseq, em plataforma SOLiD. O transcriptoma de células crescidas em nitrato foi comparado com transcriptoma de H. seropedicae crescido na presença de amônio. De um total de 4804 genes, 1619 estavam diferencialmente expressos, 377 dos quais estavam induzidos e 1242 reprimidos. Os genes narGHI estão entre os genes mais induzidos em nitrato. Os genes que codificam para a provável nitrato redutase assimilatória também estavam induzidos. Na segunda abordagem, ensaios de ?-galactosidase foram utilizados para estudar a regulação dos operons narXL, narK1UGHJImoaA e nasFED. A expressão dos operons narXL e narK1UGHJImoaA foi induzida em baixo nível de oxigenação por Fnr. A expressão do último operon também foi induzida por nitrato. A expressão do operon nasFED foi induzida por nitrato e em condições limitantes de nitrogênio através das proteínas membros do sistemas de dois componentes NtrB/NtrC e NtrY/NtrX. Finalmente, na terceira abordagem, estirpes mutantes nasA e narG de H. seropedicae foram construídas e caracterizadas. Quando estas estirpes foram cultivadas em nitrato como fonte de nitrogênio, o mutante narG- mostrou um crescimento mais lento em relação a estirpe selvagem, enquanto que o mutante nasA- não foi capaz de crescer. Os resultados sugerem que a nitrato redutase assimilatória é essencial para assimilação de nitrato, mas o papel da nitrato redutase respiratória ainda não é conhecido.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is an endophytic nitrogen-fixing bacterium that associates with gramineous plants of economic importance. In addition to genes involved with nitrogen fixation, this microorganism also contains some genes involved with nitrate metabolism, including genes encoding a putative assimilatory (nasA e Hsero_2899) and a respiratory nitrate reductase (narGHJI). However, the role of the latter enzyme in H. seropedicae is unknown because this microrganism is not capable to grow in anaerobiosis using nitrate as the only nitrogen source. In addition to the nitrate reductases, this organism also contains genes that encode to putative nitrate transporters (narK, narK1U e nasFED) and regulatory proteins (nasR e narXL). Some of these genes were studied before; however, the regulation and function of them in H. seropedicae are not completely understood. In order to understand how some of the genes related to nitrate metabolism are regulated and the roles of the nitrate reductases, it was used three approaches. First, total RNA from the H. seropedicae strain SmR1 grown on nitrate as the sole nitrogen source was extracted, depleted of rRNA and used for RNAseq transcriptional profiling on a plataform SOLiD 4. The transcriptome of nitrate-grown cells was compared to that of H. seropedicae grown in the presence of ammonium. Out of 4804 genes, 1619 were differentially expressed, 377 of which were induced and 1242 repressed. The putative narGHJI operon were amongst the most upregulated genes. Genes encoding the putative assimilatory nitrate reductase were also induced. In the second approach, â-galactosidase assays were used to study the regulation of the narXL, narK1UGHJImoaA and nasFED operons. The expression of narXL and narK1UGHJImoaA operons was induced in low level of oxygen by Fnr, but the latter operon is also induced on nitrate. The expression of nasFED operon was induced on nitrate and on nitrogen-limiting condition by NtrB/NtrC and NtrY/NtrX. Finally, in the third approach, knockout strains containing in-frame mutant nasA and narG of H. seropedicae were constructed and characterized. When these strains were grown on nitrate as nitrogen source, the narG- mutant showed a delay in growth whereas the nasA- mutant was not able to grow. The results suggest that the assimilatory nitrate reductase is essential for assimilation of nitrate, but the role of the respiratory nitrate reductase is still unclear.119f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesBactérias nitrificantesNitrato redutaseBioquímicaGenes do metabolismo de nitrato em Herbaspirillum Seropedicae : regulação transcricional em análise funcionalinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - PALOMA BONATO.pdfapplication/pdf4834434https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/32230/1/R%20-%20D%20-%20PALOMA%20BONATO.pdfcecba2ceff0485f3ff30af37b6b7bd2cMD51open accessTEXTR - D - PALOMA BONATO.pdf.txtExtracted Texttext/plain212376https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/32230/2/R%20-%20D%20-%20PALOMA%20BONATO.pdf.txt68a5f9b2d64c05e0dc675c3ae1b6e171MD52open accessTHUMBNAILR - D - PALOMA BONATO.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1103https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/32230/3/R%20-%20D%20-%20PALOMA%20BONATO.pdf.jpg95aea2aeabd83e59b77aed09bbd4e602MD53open access1884/322302018-10-08 14:01:29.842open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/32230Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082018-10-08T17:01:29Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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