Otimização da produção de uma hialuronidase recombinante em sistema de expressão eucarioto, clonagem e expressão do seu domínio catalítico e avaliação funcional com ênfase na atividade alergênica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Leite, Isabel de Oliveira
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/79549
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Luiza Helena Gremski
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spelling Veiga, Silvio Sanches, 1962-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularGremski, Luiza Helena, 1982-Leite, Isabel de Oliveira2022-10-31T15:15:22Z2022-10-31T15:15:22Z2022https://hdl.handle.net/1884/79549Orientadora: Profa. Dra. Luiza Helena GremskiCoorientador: Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 05/09/2022Inclui referências: p. 75-82Resumo: As hialuronidases são enzimas que clivam o ácido hialurônico e através desta atividade atuam como um fator de espalhamento de moléculas nos tecidos. As hialuronidases presentes no veneno de animais são semelhantes a hialuronidases de mamíferos, devido a isso, essa enzima vem sendo estudada e avaliada para aplicações farmacológicas e biotecnológicas. Algumas destas enzimas têm sido aplicadas na otimização da entrega de drogas terapêuticas aos seus alvos e na correção de preenchimentos de ácido hialurônico. As hialuronidases recombinantes do veneno de Loxosceles obtidas em modelos de expressão eucarioto (LiHyal2) e procarioto (Dietrich's hyaluronidase) se mostram promissoras para tais potenciais de aplicação. No entanto, o rendimento de LiHyal2 era baixo, enquanto Dietrich's hyaluronidase era obtida inativa. Portanto, a otimização da expressão dessa toxina em bactérias e em células de inseto é uma etapa essencial a ser cumprida se existe um propósito de aplicação na indústria. Dessa forma, a otimização da produção da LiHyal2 foi um dos objetivos do presente estudo. Sabe-se que as hialuronidases presentes no veneno de outros artrópodes, como as de abelhas, são alérgenos. No entanto, não estava claro se hialuronidases loxoscélicas eram alergênicas. Portanto, também pensando no propósito de aplicação dessa proteína na indústria, este estudo fornece resultados da avaliação da atividade biológica da hialuronidase do veneno de Loxosceles com enfoque na atividade alergênica. A clonagem do domínio catalítico da hialuronidase de L. intermedia também foi meta desse estudo, pois a sua estrutura conta com um domínio adicional que, segundo estudos com toxinas homólogas, não tem influência direta na sua atividade catalítica, mas poderia estar dificultando a sua expressão como proteína solúvel em sistema de expressão procarioto. Foram estabelecidos 4 protocolos para otimizar a expressão da LiHyal2 em células de inseto, variando a adição da suspensão de vírus durante a expressão e o tempo de expressão. Um deles rendeu 12 mg/L, sendo estabelecido como a melhor estratégia de produção da LiHyal2. A proteína purificada foi analisada quanto às suas principais características individuais (massa molecular, imunodetecção e atividade enzimática) e os resultados confirmaram os aspectos inerentes da LiHyal2. Anticorpos produzidos contra a LiHyal2 foram capazes de reconhecer epítopos de hialuronidase nativa nos venenos de L. intermedia, L. gaucho e L. laeta, mostrando conservação desta molécula em diferentes venenos de espécies de Loxosceles. Resultados dos efeitos biológicos causados por LiHyal2 revelaram que sozinha não é potencialmente alergênica ou inflamatória: não foi capaz de aumentar a permeabilidade vascular, não provocou influxo de cálcio em células RBL-2H3 e degranulação de mastócitos, e nem edema exacerbado. Foi detectado apenas edema residual dose-dependente em pata de camundongos. Além disso, as análises histológicas da pele de coelhos após inoculação da LiHyal2 mostram um leve infiltrado inflamatório e desorganização das fibras de colágeno da derme. Com base nessas observações, é provável que esse edema seja desencadeado pelo dano tecidual resultante da ação enzimática da LiHyal2 sobre o ácido hialurônico do tecido, o que estimularia essa leve resposta inflamatória. O domínio catalítico da hialuronidase de L. intermedia foi clonado com sucesso e essa construção será uma ferramenta importante para a expressão dessa nova proteína. A otimização da produção da LiHyal2 e os resultados que demonstram ausência de atividade alergênica por parte dessa proteína recombinante fortalecem a viabilidade de utilização dessa enzima para aplicações terapêuticas.Abstract: Hyaluronidases are enzymes that cleave the hyaluronic acid and through this activity act as a factor of spreading molecules in tissues. The hyaluronidases present in animal venom are similar to mammalian hyaluronidases, due to this, this enzyme has been studied and evaluated for pharmacological and biotechnological applications. Some of these enzymes have been applied to optimize the delivery of therapeutic drugs to their targets and to correct hyaluronic acid fillers. Recombinant hyaluronidases from Loxosceles venom obtained in eukaryotic (LiHyal2) and prokaryotic (Dietrich's hyaluronidase) expression models show promise for such potential applications. However, the yield of LiHyal2 was low, while Dietrich's hyaluronidase was obtained inactive. Therefore, the optimization of the expression of this toxin in bacteria and in insect cells is an essential step to be fulfilled if there is an application purpose in industry. Thus, the optimization of LiHyal2 production was one of the objectives of the present study. Hyaluronidases present in the venom of other arthropods, such as those of bees, are known to be allergens. However, it was not clear whether Loxosceles hyaluronidases were allergenic. Therefore, also with the purpose of application of this protein in industry in mind, this study provides results of the evaluation of the biological activity of hyaluronidase from Loxosceles venom with a focus on allergenic activity. The cloning of the catalytic domain of the hyaluronidase from L. intermedia was also a goal of this study, since its structure has an additional domain which, according to studies with homologous toxins, has no direct influence on its catalytic activity, but could be hindering its expression as a soluble protein in a prokaryotic expression system. Four protocols were established to optimize the expression of LiHyal2 in insect cells, varying the addition of the virus suspension during expression and the expression time. One of them yielded 12 mg/L, being established as the best LiHyal2 production strategy. The purified protein was analyzed for its main individual characteristics (molecular mass, immunodetection and enzymatic activity) and the results confirmed the inherent aspects of LiHyal2. Antibodies produced against LiHyal2 were able to recognize epitopes of native hyaluronidase in the venoms of L. intermedia, L. gaucho and L. laeta, showing conservation of this molecule in different venoms of Loxosceles species. Results of the biological effects caused by LiHyal2 revealed that alone it is not potentially allergenic or inflammatory: it was not able to increase vascular permeability, did not cause calcium influx in RBL-2H3 cells and mast cell degranulation, and neither exacerbated oedema. Only dose-dependent residual oedema was detected in mouse paw. Furthermore, histological analyses of rabbit skin after LiHyal2 inoculation show a mild inflammatory infiltrate and disorganization of collagen fibers of the dermis. Based on these observations, it is likely that this oedema is triggered by tissue damage resulting from the enzymatic action of LiHyal2 on hyaluronic acid in the tissue, which would stimulate this mild inflammatory response. The catalytic domain of the hyaluronidase from L. intermedia was successfully cloned and this construct will be an important tool for the expression of this new protein. The optimization of LiHyal2 production and the results that demonstrate the absence of allergenic activity by this recombinant protein strengthen the viability of using this enzyme for therapeutic applications.1 recurso online : PDF.application/pdfAlergiaInflamaçãoLoxoscelesMorfologiaOtimização da produção de uma hialuronidase recombinante em sistema de expressão eucarioto, clonagem e expressão do seu domínio catalítico e avaliação funcional com ênfase na atividade alergênicainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - ISABEL DE OLIVEIRA LEITE.pdfapplication/pdf4780034https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/79549/1/R%20-%20D%20-%20ISABEL%20DE%20OLIVEIRA%20LEITE.pdf28ee1be0ae64ee2707351b918d377b5cMD51open access1884/795492022-10-31 12:15:22.839open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/79549Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082022-10-31T15:15:22Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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