Expressão e análise de atividade enzimática da deubiquitinase USP2a recombinante

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bueno, Mariane Pagno de Souza
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/88050
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Silvio Marques Zanata
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spelling Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Zanata, Silvio Marques, 1974-Bueno, Mariane Pagno de Souza2024-05-15T20:37:46Z2024-05-15T20:37:46Z2024https://hdl.handle.net/1884/88050Orientador: Prof. Dr. Silvio Marques ZanataDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 02/02/2024Inclui referênciasResumo: Neste estudo foi realizada a expressão da forma completa e ativa da proteína USP2a e avaliado sua atividade enzimática perante diferentes substratos. A enzima deubiquitinase USP2a está envolvida com diversos processos celulares, e defeitos em sua expressão estão presentes em diversas patologias, como o hepatocarcinoma e câncer de próstata, sendo vista como um possível alvo terapêutico. Entretanto, até o momento, nenhum inibidor seletivo dessa proteína é conhecido. Uma das alternativas para a busca de inibidores está na possibilidade em realizar a varredura de biblioteca de compostos através de ensaios em larga escala, onde diversos compostos podem ser testados simultaneamente. Para a realização desses testes de inibição, torna-se imperativa a obtenção da USP2a purificada e com retenção da sua atividade enzimática. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi a expressão da proteína USP2a recombinante em sistema heterólogo bacteriano e análise de sua atividade. Assim, purificou-se a USP2a e o seu substrato UBA52 após cultura e expressão na cepa BL21(DE3) de E. coli, sendo realizados ensaios de deubiquitinação para testar a atividade da deubiquitinase. Foi visto que a USP2a expressa é enzimaticamente ativa, potencialmente capaz de degradar seu substrato conhecido, o precursor de ubiquitina UBA52. Ademais, ensaios preliminares mostraram a ação dessa enzima em outros dois precursores, UBA80 e HsUBB. Concomitantemente, foi validado o uso da USP2a recombinante no ensaio de clivagem da Ub-Rhod110-G, um substrato fluorescente de deubiquitinases que emite fluorescência quando clivado. Essa metodologia pode ser utilizada em microplacas para a varredura de bibliotecas de compostos. Com a realização desse trabalho, foi possível obter a USP2a recombinante enzimaticamente ativa, bem como a validação de seu uso em um ensaio para varredura em larga escala, possibilitando, a partir dele, a busca de inibidores seletivos da USP2a.Abstract: In this study, the active full length form of the USP2a protein was expressed and its enzymatic activity against different substrates was evaluated. The deubiquitinase enzyme USP2a is involved in several cellular processes, and defects in its expression is present in a variety of pathologies, such as hepatocellular carcinoma and prostate cancer, being seen as a possible therapeutic target. However, to date, no selective inhibitor of this protein is known. One of the alternatives for searching for inhibitors is the possibility of screening the compound library through high-throughput assays, where several compounds can be tested simultaneously. To carry out these inhibition tests, it’s imperative to obtain purified USP2a and retain its enzymatic activity. Therefore, the objective of this work was the expression of the recombinant USP2a protein in a heterologous bacterial system and analysis of its activity. Thus, USP2a and its substrate UBA52 were purified after culture and expression in the BL21(DE3) strain of E. coli, and deubiquitination assays were performed to test the deubiquitinase activity. USP2a was found to enzymatically active, potentially capable of degrading its known substrate, the ubiquitin precursor UBA52. Furthermore, preliminary tests demonstrated the action of this enzyme on two other precursors, UBA80 and HsUBB. Concomitantly, the use of recombinant USP2a was validated in the Ub-Rhod110-G cleavage assay, a fluorescent substrate of deubiquitinases that emits fluorescence when cleaved. This methodology can be used on microplates to scan compound libraries. With this work, it was possible to obtain enzymatically active recombinant USP2a, as well as validating its use in a high-thropout screnning assay, enabling the search for selective USP2a inhibitors.1 recurso online : PDF.application/pdfEnzimasProteínasBioquímicaExpressão e análise de atividade enzimática da deubiquitinase USP2a recombinanteinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - MARIANE PAGNO DE SOUZA BUENO.pdfapplication/pdf1596980https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/88050/1/R%20-%20D%20-%20MARIANE%20PAGNO%20DE%20SOUZA%20BUENO.pdf7a399f97cd4e5ab47d090788320abdd7MD51open access1884/880502024-05-15 17:37:46.396open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/88050Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-05-15T20:37:46Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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