Influência da melanogênese sobre funções mitocondriais e autofagia em células de melanoma murino B16-F10

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Meira, Willian Vanderlei
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/65351
Resumo: Orientadora : Profª Drª Glaucia Regina Martinez
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spelling Meira, Willian VanderleiCadena, Silvia Maria Suter Correia, 1967-Heinrich, Tassiele AndréaUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Martinez, Glaucia Regina2020-01-22T21:24:38Z2020-01-22T21:24:38Z2015https://hdl.handle.net/1884/65351Orientadora : Profª Drª Glaucia Regina MartinezCo-orientadora : Profª Drª Silvia Maria Suter Correia CadenaCo-orientadora : Drª Tassiele Andréa HeinrichDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/03/2015Inclui referênciasResumo: O melanoma está entre os mais raros e agressivos tumores que atingem a pele. Devido a sua alta agressividade e seu grande poder de metástase, a sobrevida de pacientes diagnosticados tardiamente é bastante baixa. Um dos principais motivos para a dificuldade no tratamento desse tipo de tumor é a presença da melanina, um pigmento que confere cor à pele, olhos e pelos. A principal função da melanina é proteger as células epiteliais de danos provocados pela radiação solar, através da absorção dessa radiação e da captação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Mas estudos com linhagens de melanoma mostram que esse pigmento apresenta outras funções na célula, produzindo ROS quando irradiado com radiação ultravioleta (UV) e durante a sua síntese. O estímulo melanogênico mostrou-se ainda capaz de induzir a entrada em G0, estado conhecido como quiescência, que é caracterizado pela parada reversível na proliferação celular, geralmente desencadeado por falta de nutrientes, hipóxia ou ação de xenobióticos. Nesse estado, a célula diminui suas taxas metabólicas e de proliferação, ativando vias catabólicas, como as vias autofágicas, a fim de obter nutrientes e/ou eliminar organelas através da degradação seletiva via lisossomo. A melanogênese também alterou o perfil de expressão de diversas proteínas e os níveis de ADP/ATP na célula. Sabe-se que a mitocôndria é responsável pela produção da maior parte do ATP celular e que mudanças em seu funcionamento podem levar a alterações no metabolismo, aumento de ROS, parada do ciclo celular e até mesmo desencadear mecanismos de morte. Tendo em vista os efeitos do estímulo melanogênico utilizando L-tirosina e cloreto de amônio sobre células de melanoma murino B16-F10, esse estudo tem como objetivo investigar, nessas células, processos celulares que possam estar envolvidos na indução ao estado quiescente mediado por 48 horas de estímulo melanogênico, analisando principalmente os efeitos sobre parâmetros mitocondriais e autofágicos. Para isso, as células foram estimuladas com 0,4 mM L-tirosina e 10 mM NH4Cl durante 24 e 48 horas. A viabilidade celular foi observada através dos métodos do MTT e Cristal Violeta, já a indução do processo autofágico foi avaliada através de western blotting de marcadores específicos como LC3 e Beclin-1. A respiração celular foi avaliada por respirometria de alta resolução na presença de diferentes inibidores e desacopladores da cadeia respiratória mitocondrial; o potencial de membrana mitocondrial (??m) também foi avaliado, utilizando- se a sonda fluorescente JC-1 e por fim, o número de mitocôndrias, após o estímulo na síntese de melanina, foi estimado através da marcação mitocondrial com Mitotracker Green FM. Nossos resultados mostraram que o estímulo melanogênico foi capaz de inibir o crescimento das células de melanoma, promovendo uma diminuição no consumo de oxigênio após 48 horas de incubação. Esse estímulo ainda promoveu aumento nos níveis autofágicos, sem induzir a degradação seletiva da mitocôndria. Em relação ao colapso do potencial de membrana mitocondrial, não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controle e as células B16-F10 após 24 ou 48 horas de estímulo da melanogênese. Essas observações apontam o provável envolvimento da mitocôndria sobre a indução da quiescência promovida pelo estímulo melanogênico e ainda nos dão subsídios para sugerir uma possível inibição promovida pela síntese de melanina ou pela ação de algum intermediário dessa reação sobre um dos complexos da cadeia transportadora de elétrons, mas estudos mais aprofundados necessitam ser realizados para confirmar essa hipótese. Palavras- chave: Melanina. Consumo de oxigênio. Autofagia. Mitofagia.Abstract: Melanoma is among the most rare and aggressive tumors affecting the skin. Due to its high aggressiveness and its great power of metastasis, survival of patients diagnosed late is quite low. A major reason for the difficulty in treating this type of tumor is the presence of melanin, a pigment that gives color to skin, eyes and hair. The main function of melanin is to protect skin cells from damage caused by solar radiation, through the absorption of this radiation and quenching of reactive oxygen species (ROS). However, studies on melanoma cell lines show that the pigment has other functions in the cell, it produces ROS when irradiated with ultraviolet (UV) radiation and during its synthesis. Under melanogenesis stimulation, cells were able to entry into G0, known as quiescent state, which is characterized by reversible cell proliferation arrest, usually triggered by a lack of nutrients or hypoxia action of xenobiotics. In this state, cells decrease proliferation and their metabolic rates, enabling catabolic pathways such as the autophagic pathways to obtain nutrients or organelles removing by selective degradation via lysosome. The melanogenesis may also change the profile of various protein expression and ADP/ATP levels in the cell. It is known that mitochondria are responsible for producing most of the cellular ATP and changes in their operation can lead to changes in metabolism, increased ROS, cell cycle arrest and even triggering of mechanisms of death. In view of the effects of stimulus of melanogenesis using L-tyrosine and ammonium chloride on murine melanoma B16-F10, this study aims to investigate, in these cells, cellular processes that may be involved in the quiescent state induced after 48 hours of stimulus of melanogenesis, mainly analyzing the effects on mitochondrial and autophagic parameters. For this proposal, cells were stimulated with 0.4 mM L-tyrosine and 10 mM NH4Cl for 24 to 48 hours. Cell viability was observed by MTT and crystal violet methods, induction of autophagic process was assessed by Western blotting by specific markers LC3 and beclin-1. Cellular respiration was assessed by respirometry of high resolution in the presence of different inhibitors and uncouplers of mitochondrial respiratory chain. The mitochondrial membrane potential (??m) was also evaluated, using the fluorescent probe JC-1 and finally the number of mitochondria after stimulation in melanin synthesis was estimated using mitochondrial staining with Mitotracker Green FM. Our results showed that melanogenesis stimulation was able to inhibit the growth of melanoma cells and to promote a decrease in oxygen consumption after 48 hours of incubation. This stimulation also promoted increase in autophagic levels without inducing selective degradation of mitochondria. In relation to the collapse of mitochondrial membrane potential, no significant differences were observed between the control group and the B16-F10 cells after 24 or 48 hours of stimulation of melanogenesis. These observations point to the likely involvement of mitochondria on the induction of quiescence promoted by melanogenic stimulus and still give subsidies to suggest a possible inhibition promoted by melanin synthesis or by the action of some intermediate of this reaction on some complex of the electron transport chain, but further studies need to be conducted to confirm this hypothesis. Key words: Melanin. Oxygen consumption. Autophagy. Mitophagy.71f. : il. algumas color., tabs., grafs.application/pdfDisponível em formato digitalBioquímicaMelanomaMelaninaInfluência da melanogênese sobre funções mitocondriais e autofagia em células de melanoma murino B16-F10info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALT - WILLIAN VANDERLEI MEIRA.pdfapplication/pdf3542361https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/65351/1/T%20-%20WILLIAN%20VANDERLEI%20MEIRA.pdf1de503d7d04688572d6471457b777bc5MD51open access1884/653512020-01-22 18:24:38.789open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/65351Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082020-01-22T21:24:38Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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