Isolamento, identificação e sensibilidade a fungicidas de fungos do gênero Colletotrichum de plantas de pomares cítricos

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Waculicz-Andrade, Caroline Elise, 1982-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/40382
Resumo: Orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke
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spelling Waculicz-Andrade, Caroline Elise, 1982-Spósito, Marcel BellatoUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em GenéticaBlanco, Chirlei Glienke de2015-12-02T14:57:54Z2015-12-02T14:57:54Z2013http://hdl.handle.net/1884/40382Orientadora : Profª Drª Chirlei GlienkeCo-orientador : Prof. Dr. Marcel Bellato SpósitoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 21/11/2013Inclui referências ao final de cada capítuloResumo: A Podridão Floral dos Citros (PFC) é causada pela infecção de flores por fungos da espécie Colletotrichum acutatum e C. gloeosporioides, os quais produzem lesões marrom-alaranjadas nas pétalas de flores, acarretando a abscisão de frutos jovens e retenção de cálice.O patógeno é amplamente distribuído nos trópicos úmidos das Américas, principalmente em locais que propiciam mais de uma florada dos citros (Citrus spp.). A doença está presente em regiões do estado de São Paulo, Brasil, onde as condições climáticas são favoráveis. Na literatura não há relatos da presença de linhagens não patogênicas de Colletotrichum de forma endofítica; ou se está presente como patógeno latente em plantas cítricas ou em plantas da vegetação espontânea entre as floradas contribuindo como reservatório de inóculo para a disseminação da doença. Inicialmente, o agente causal da PFC foi identificado como sendo Colletotrichum gloeosporioides. Posteriormente, estudos utilizando marcadores moleculares, constataram que o agente responsável pela doença é C. acutatum. Estudo envolvendo teste de patogenicidade identificou o fungo C. gloeosporioides novamente como agente causal da PFC. A principal medida de controle da PFC é a utilização de pulverizações com fungicidas durante o florescimento e o desenvolvimento de isolados resistentes é uma grande preocupação no manejo da doença. A possibilidade de uso de Agrobacterium tumefaciens como ferramenta biotecnológica para realizar a transferência de gene de interesse para outros organismo é uma metodologia utilizada para estudos de interação planta-fungo. Dessa forma, os objetivos desse trabalho foram isolar e identificar as espécies de Colletotrichum endofíticos de plantas cítricas e plantas da vegetação espontânea por meio de características morfológicas e moleculares por PCR e sequenciamento multigênico; avaliar a patogenicidade dos isolados em flores de citros, verificar a resistência dos isolados quanto aos fungicidas carbendazim e triazol juntamente com o sequenciamento parcial do gene da ?-tubulina; além de analisar o processo de penetração e colonização por meio de isolado agrotransformado com a expressão da proteína DsRed. Assim, foram obtidos 189 isolados endofíticos, 120 de plantas cítricas e 69 de plantas da vegetação espontânea, identificados por PCR como pertencentes ao Complexo de espécies C. gloeosporioides e por análise multigênica identificados como sendo da espécie C. gloeosporioides stricto sensu. Foi possível a identificação de uma região de 22 nucleotídeos variáveis no último exon do gene 18S do rDNA, gerando alteração na conformação do RNA ribossômico, ainda sem correlação com funcionalidade. O teste de patogenicidade permitiu identificar um isolado endofítico de citros causando sintomas da PFC em flores de citros. A resistência ao fungicida carbendazim foi observada em 37 dos 120 isolados de plantas de citros, todos de um mesmo pomar de citros com aplicação do fungicida há mais de 10 anos; e 43 dos 69 isolados de plantas da vegetação espontânea, todos categorizados como altamente resistentes; indicando que sua utilização prolongada gera isolados resistentes diminuindo sua efetividade no campo. O fungicida triazol teve sua concentração efetiva para inibição de 50% do crescimento micelial (CE50) e a concentração mínima inibitória (CMI) alteradas quando comparados isolados de C. gloeosporioides e C. acutatum, sendo a efetividade de controle diminuída em isolados de C. gloeosporioides. Para o gene da ?- tubulina, todos os 189 isolados de C. gloeosporioides apresentaram a mesma sequência. Não havendo alteração na região de nucleotídeos que codificam para os códons onde já houve relato de mutação e associação com resistência a fungicidas. No entanto, nos códons 76, 80, 82, 169, 203 e 236 foram verificadas alterações na sequência dos nucloetídeos sem alteração do aminoácido gerado, até o momento sem associação com resistência ou identificação de sua funcionalidade. Foi ainda possível identificar penetração e colonização do isolado LGMF540-1t agrotransformado para a expressão da proteína DsRed após 28 dias de inoculação em folhas de citros, permitindo verificar a capacidade de infecção deste isolado endofítico de folha de citros. Palavras chave: Colletotrichum gloeosporioides, Sequenciamento multigênico, resistência a fungicidas, Agrotransformação, Podridão Floral dos Citros (PFC).Abstract: The Postbloom Fruit Drop (PFC) is caused by infection of flowers by Colletotrichum acutatum and C. gloeosporioides, produces orange-brown lesions on petals and results in premature fruit drop and the retention of calyces. The pathogen is widely distributed in the humid tropics of the Americas, especially in places that provide more than one flowering citrus (Citrus spp.). The disease is present in regions of the state of São Paulo, Brazil, where climatic conditions are favorable. There are no published reports of the presence of non-pathogenic strains of endophytic Colletotrichum, or if it is present as latent pathogen in citrus plants or plants of natural vegetation between flowering contributing as as reservoir of inoculum for the spread of the disease. Initially, the causal agent of PFC was identified as Colletotrichum gloeosporioides. Subsequently, studies using molecular markers, found that the agent responsible for the disease is C. acutatum .Study involving pathogenicity test identified the fungus C. gloeosporioides as a new causal agent of PFD. It is mainly controlled by fungicide sprays during flowering. and the development of resistant strains is a major concern in the management of the disease The possibility of the use of Agrobacterium tumefaciens as a biotechnological tool to transfer gene of interest to other organism,it is a methodology used to estudy the interaction plant-fungus. Thus, the present study aimed toisolate and identify the species of endophytic Colletotrichum isolates from citrus plants and natural vegetation through morphological and molecular characteristics as PCR and multigenic sequencing; evaluate the pathogenicity of the isolates in citrus flowers, verify the resistance of the isolates to carbendazim and triazole fungicide, and partial ?-tubulin gene sequence; and analyse the process of penetration and colonization by an isolate agrotransformed expressing the protein DsRed. Were obtained 189 endophytic isolates, 120 from citrus plants and 69 from plants of natural vegetation identified by PCR as belonging to the C. gloeosporioides species complex, multigene analysis identified all the isolates as the species C. gloeosporioides stricto sensu. Identification of variable region of 22 nucleotides in the last exon of the gene18S rDNA gene, generating changes in the conformation of the ribosomal RNA, without correlation with functionality The pathogenicity test identified an isolate endophytic from citrus causing symptoms of PFC in citrus flowers The resistance to carbendazim fungicide was observed in 37 of the 120 isolates from citrus plants, all from one citrus orchard with the application of the fungicide over 10 years; and 43 of the 69 isolates from natural vegetation, all categorized as highly resistant, indicating that its prolonged use generates resistant isolates decreasing its effectiveness in the field . The triazole fungicide had its effective concentration for 50% inhibition of mycelial growth (EC50) and the minimum inhibitory concentration (MIC) changed compared isolates of C. acutatum and C. gloeosporioides; and the effectiveness of control decreased in isolates of C. gloeosporioides. For the ?-tubulin gene, all 189 isolates of C. gloeosporioides showed the same sequence. There was no change in the nucleotide region encoding codons which have been reported mutations associated with resistance to fungicides. However, in codons 76, 80, 82, 169, 203 and 236 changes occur in the nucelotide sequence without altering the amino acid generated, to the moment no association with resistance or identification of its functionality; also was possible to identify penetration and colonization of isolated LGMF540 - 1t agrotransformed with gene DsRed after 28 days of inoculation in citrus leaves, allowing to characterize how the infection process occurs in the presence of citric endophytic isolates. Keywords: Colletotrichum gloeosporioides, Multigene sequencing, Fungicide resistence, Agrotransformation, Postbloom Fruit Drop (PFD).128 f. : il., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalGenéticaFungosCítricosFungicidasColleototrichum gloeosporioidesIsolamento, identificação e sensibilidade a fungicidas de fungos do gênero Colletotrichum de plantas de pomares cítricosinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessTEXTR - T - CAROLINE ELISE WACULICZ-ANDRADE.pdf.txtExtracted Texttext/plain256397https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/40382/1/R%20-%20T%20-%20CAROLINE%20ELISE%20WACULICZ-ANDRADE.pdf.txt6528b198433562cfe678c8645de1c4f7MD51open accessORIGINALR - T - CAROLINE ELISE WACULICZ-ANDRADE.pdfapplication/pdf1936034https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/40382/2/R%20-%20T%20-%20CAROLINE%20ELISE%20WACULICZ-ANDRADE.pdf17b08ce48e1b8c92a3f652716985a5b8MD52open accessTHUMBNAILR - T - CAROLINE ELISE WACULICZ-ANDRADE.pdf.jpgR - T - CAROLINE ELISE WACULICZ-ANDRADE.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1181https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/40382/3/R%20-%20T%20-%20CAROLINE%20ELISE%20WACULICZ-ANDRADE.pdf.jpge6650760a153bee59492fee887c3133bMD53open access1884/403822016-04-07 05:38:24.161open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/40382Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082016-04-07T08:38:24Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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