Geração e caracterização de anticorpos monoclonais para dengue e hantavírus : desenvolvimento de insumos com potencial biotecnológico aplicado a saúde

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mazzarotto, Giovanny Augusto Camacho Antevere
Data de Publicação: 2009
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/20460
Resumo: Orientadora: Claudia Nunes Duarte dos Santos
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spelling Bordignon, JulianoUniversidade Federal do Paraná. Setor de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaSantos, Claudia Nunes Duarte dosMazzarotto, Giovanny Augusto Camacho Antevere2024-04-12T17:27:46Z2024-04-12T17:27:46Z2009https://hdl.handle.net/1884/20460Orientadora: Claudia Nunes Duarte dos SantosCoorientador: Juliano BordignonDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 14/04/2009Inclui bibliografia e anexosÁrea de concentração: Saúde animal e humanaResumo: A dengue e a hantavirose são infecções virais que podem provocar quadros clínicos graves e óbito. A infecção por qualquer um dos sorotipos da dengue (-1, -2, -3 e -4) pode causar infecções assintomáticas ou com febre indiferenciada; febre hemorrágica da dengue (DHF), ou ainda síndrome de choque da dengue (DSS). A hantavirose, por sua vez, é uma doença emergente nas Américas e no Brasil causando uma síndrome cardiopulmonar (SCPH), com taxas de mortalidade em torno de 40%. Considerando que os sintomas da dengue e da hantavirose são pouco específicos para diferenciá-los de outras doenças febris, o desenvolvimento de diagnósticos laboratoriais para essas doenças torna-se de extrema importância. A detecção de antígenos virais por anticorpos monoclonais surge como uma alternativa de menor custo e maior rapidez para o diagnóstico da dengue e hantavirose. O objetivo do presente trabalho foi a produção e caracterização de linhagens celulares híbridas produtoras de anticorpos monoclonais (mAbs) contra três sorotipos do vírus da dengue circulantes no Brasil, e contra a nucleoproteína recombinante do hantavírus Araucária. Para a produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra dengue animais foram inoculados com as cepas virais DEN1 BR-01/MR, DEN2 BR EN-02 e DEN3 BR 290-02 individualmente ou simultâneamente na tentativa de gerar mAbs grupo-específicos de dengue. Para a produção de monoclonais contra hantavirus camundongos foram imunizados com a nucleoproteína recombinante de hantavirus (rNH) expressa em sistema procariótico.Três dias após o término das imunizações os esplenócitos foram fusionados com a linhagem celular mielômica murina Ag8XP3653 utilizando polietilenoglicol. Os hibridomas gerados foram selecionados pelos meios HAT/HT durante doze dias. Os protocolos de fusão de dengue geraram 960, 660 e 984 clones para DEN1 BR-01/MR, DEN2 BR EN-02 e DEN3 BR 290-02, respectivamente. Foram triados 1100 clones por imunofluroescência indireta (IFI) e dois clones por ensaios de absorção imunoenzimático (ELISA) sendo obtidos 131 clones positivos (11.88%) com diferentes padrões de fluorescência. O protocolo de fusão para hantavirus gerou 440 clones, dos quais 352 foram clones triados por ensaios ELISA. Foram obtidos 174 clones positivos (43.5%). Uma parcela dos clones positivos foi estabilizada e subclonada gerando três clones estáveis da imunização com BR-01/MR (695 12C/2H, 512 10A/8A, 906 4H/9A); Três clones com a imunização da cepa de DEN2 BR EN-02 (658/9A, 646/9G, 332/2D); e três clones a partir da imunização com a cepa DEN3 BR 290-02 (424/8G, 918/6A, 920/11C). Através de ensaios de IFI os anticorpos 424/8G, 918/6A, 920/11C, 512 10A/8A, 906 4H/9A e 695 12C/2H mostraram-se reativos com as três cepas utilizadas no experimento Diferentemente, os anticorpos 646/9G, 332/2D e 658/9A foram específicos para a cepa DEN2 BR EN-02. Ensaios de western blot demonstraram a reatividade dos clones 332/2D e 424/8G com as proteínas E dom B de DEN2 e prM/E de DEN3, respectivamente. Da etapa de fusão das linhagens celulares para a obtenção de anticorpos monoclonais para o antígeno de hantavírus foram obtidos 9 clones estáveis (350/8C, 581/8G, 475/8A, 313/11E, 572/7A, 432/6BF, 664/10G, 305/5A, 651/6G). Estes clones foram caracterizados através de ensaios de western blotting, IFI e imunohistoquímica. Os resultados obtidos indicaram especificidade dos mAbs no reconhecimento da proteína rNH nos diferentes ensaios, além da aplicabilidade dos mesmos em ensaios de imunohistoquímica. A produção de anticorpos monoclonais que possam ser utilizados tanto para a pesquisa básica, imunoterápicos ou como componentes em kits para o daignóstico de diferentes agravos de notificação complusória gera independência e autonomia na produção destes insumos em nosso país.Abstract: Dengue (DEN) and Hantavirus are viral infections that can lead to severe clinical symptoms and death. Infection by any of the dengue sorotypes (-1, -2, -3, and -4) can be asymptomatic or cause an undifferentiated fever called dengue fever (DF), dengue hemorrhagic fever (DHF) or dengue shock syndrome (DSS). Hantavirus infection, in turn, is an emerging disease in the Americas and Brazil, causing human pulmonary syndrome (SCPH) with mortality rate around 40%. Because dengue and hantavirus infection symptoms are not specific to be used in a differential diagnostic against other fever diseases, the development of clinical diagnostic tools for these diseases is of extreme importance. Viral antigen detection by monoclonal antibodies is a low cost and fast alternative to the diagnostic of dengue and hantavirus infections. The aim of this work was the production and characterization of hybridoma cells line secreting monoclonal antibodies (mAbs) against the three sorotypes of dengue circulating in Brazil, and against the Araucaria hantavirus recombinant nucleoprotein. Animals were inoculated with the viral strains DEN-1 BR-01/MR, DEN2 EN-02 and DEN3 BR 290-02 to produce hybridoma cells secreting mAbs. To generate mAbs against hantavirus, mice were immunized with a recombinant nucleoprotein (rNH) previously produced in a prokaryotic system. Three days after the immunization, splenocytes were fused with the murine cell line Ag8XP3653 using polyethileneglicol. The hybridoma cells were selected through HAT/HT medium for twelve days. Dengue fusion protocols generated 960, 660, and 984 clones for DEN-1 BR-01/MR, DEN2 EN-02 and DEN3 BR 290-02, respectively. We screened 1100 clones by indirect immunofluorescence (IFI) and 2 clones by the enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA), whereby we obtained 131 positive clones (11.88%) with different fluorescence levels. Hantavirus fusion protocols generated 440 clones, from which 352 clones were selected by ELISA screening with a yield of 174 positive clones (43.5%). Some clones were stabilized and subcloned producing three stable hybridoma cells from the BR-01/MR immunization (695 12C/2H, 512 10A/8A, 906 4H/9A), three hibridomas cells from the DEN2 BR EN-02 strain immunization (658/9A, 646/9G, 332/2D), and three hybridoma cells from the DEN3 BR 290-02 strain immunization (424/8G, 918/6A, 920/11C). Using IFI, we observed that the mAbs 424/8G, 918/6A, 920/11C, 512 10A/8A, 906 4H/9A e 695 12C/2H were reactive to all three strains used. On the other hand, the mAbs 646/9G, 332/2D e 658/9A were specifically reactive to the strain DEN2 BR EN-02. Western blot assays showed that the clones 332/2D e 424/8G were reactive to the proteins E dom B of DEN2 and prM/E of DEN3, respectively. Hybridoma cells obtained for the production of mAbs for hantavirus produced 9 stable clones (350/8C, 581/8G, 475/8A, 313/11E, 572/7A, 432/6BF, 664/10G, 305/5A, 651/6G). These clones were characterized by western blot, IF and immunohistochemistry. The results suggest that the mAbs have high specificity for the rNH protein, thus being applicable to immunochemistry assays. Production of mAbs that can be used for basic research, immunotherapy or as components of diagnostic kits creates independence for the production of these input materials in Brazil.xii, 83f. : il. algumas color., grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalDengueAnticorpos monoclonaisHibridomasBiotecnologiaTecnologia químicaGeração e caracterização de anticorpos monoclonais para dengue e hantavírus : desenvolvimento de insumos com potencial biotecnológico aplicado a saúdeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALDissertacao virtual Giovanny para Federal.pdfapplication/pdf3905105https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/20460/1/Dissertacao%20virtual%20Giovanny%20para%20Federal.pdf7474343d5e8a3e60047dd41e22a60b81MD51open accessTEXTDissertacao virtual Giovanny para Federal.pdf.txtExtracted Texttext/plain223009https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/20460/2/Dissertacao%20virtual%20Giovanny%20para%20Federal.pdf.txt363c795ed17108d55dd9e69325cdbf7aMD52open accessTHUMBNAILDissertacao virtual Giovanny para Federal.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1535https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/20460/3/Dissertacao%20virtual%20Giovanny%20para%20Federal.pdf.jpge335dc6d9891118a7cf7b509a8e94a1eMD53open access1884/204602024-04-12 14:27:46.32open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/20460Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-04-12T17:27:46Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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