Construção e expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab de Azospirillum brasiliense

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sotomaior, Patricia
Data de Publicação: 2009
Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/30309
Resumo: Orientador: Emanuel Maltempi de Souza
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spelling Sotomaior, PatriciaAraújo, Luíza Maria deUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasSouza, Emanuel Maltempi de, 1964-2022-09-06T11:17:36Z2022-09-06T11:17:36Z2009https://hdl.handle.net/1884/30309Orientador: Emanuel Maltempi de SouzaCoorientadora: Luíza Maria de AraújoMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : A fixação biológica de nitrogênio é fundamental para disponibilizar este elemento em uma forma que seja metabolicamente utilizável pela maioria dos organismos. Nas bactérias diazotróficas, que são capazes de fixar nitrogênio, a transcrição dos genes envolvidos neste processo é ativada pela proteína NifA, que tem sua atividade controlada pelos níveis de amônio e oxigênio. Em Azotobacter vinelandii, os genes nifLA estão agrupados em um operon; a proteína NifA tem atividade constitutiva, mas é inativada por NifL em altas concentrações de amônio e/ou oxigênio. Por outro lado, em Azospirillum brasilense, apenas o gene que codifica para a proteína NifA está presente e, neste caso, a própria proteína NifA responde às alterações dos níveis de amônio e oxigênio, através de um mecanismo que envolve sua auto-inibição via o domínio N-terminal. A proteína NifA de A. brasilense é composta por três domínios separados por duas regiões interdomínios. O domínio N-terminal está relacionado com o controle da atividade da proteína por amônio enquanto que a sensibilidade ao oxigênio está relacionada ao interdomínio que conecta o domínio central ao domínio C-terminal. O domínio central é responsável pela interação com a RNA polimerase e ativação da transcrição, enquanto o domínio C-terminal interage com seqüências específicas de DNA. Para estudar o mecanismo de regulação da atividade da proteína NifA de A. brasilense e obter uma proteína NifA insensível aos níveis de amônio foram construídos dois genes quiméricos: nifAQ1Ab, que codifica o domínio N-terminal da proteína NifA de A. brasilense ligado ao domínio central + C-terminal da proteína NifA de A. vinelandii, e nifAQ2Ab, que codifica o domínio N-terminal da proteína NifA de A. vinelandii ligado ao domínio central + C-terminal da proteína NifA de A. brasilense. Fragmentos de DNA contendo as regiões de interesse foram obtidos por reação de PCR utilizando DNA genômino de A. brasilense e um plasmídeo contendo o gene nifA de A. vinelandii como moldes. Os produtos de PCR foram clonados separadamente no vetor pCR2.1. Após confirmação das seqüências de DNA clonadas, os insertos foram clivados com HindIII e XbaI e ligados no vetor pDK7. Em seguida, os genes quiméricos foram montados no vetor de expressão pET28a, unindo as regiões que correspondem aos domínios N-terminal de A. brasilense e central + C-terminal de A. vinelandii ou aos domínios N-terminal de A. vinelandii e central + C-terminal de A. brasilense. A partir da montagem dos genes quiméricos no vetor pET28a foi possível fazer a expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab em E. coli e determinar as melhores condições para sua solubilização. Os genes quiméricos foram construídos com sucesso e a expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab revelou a alta insolubilidade dessa proteína. Os ensaios de expressão mostraram que as melhores condições de expressão foram obtidas após indução a 37ºC a partir de 2 horas ou a 18ºC durante a noite, utilizando IPTG 0,5mmol/L ou lactose 0,5% como indutores.1 recurso online : PDF.application/pdfExigências do sistema: Adobe Acrobat ReaderAzospirillum brasilenseBactérias nitrificantesConstrução e expressão da proteína quimérica NifAQ1Ab de Azospirillum brasilienseinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALMonografia Patricia Sotomaior.pdfapplication/pdf1186562https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30309/1/Monografia%20Patricia%20Sotomaior.pdfd315329c13ff7b6fc0d8ef33707831a9MD51open accessTEXTMonografia Patricia Sotomaior.pdf.txtExtracted Texttext/plain102961https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30309/2/Monografia%20Patricia%20Sotomaior.pdf.txt4559a26bb42e88cbb36abce9341cb562MD52open accessTHUMBNAILMonografia Patricia Sotomaior.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1238https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/30309/3/Monografia%20Patricia%20Sotomaior.pdf.jpgcc22b83f2fae7bd9e1a4eacff2280f54MD53open access1884/303092022-09-06 08:17:36.75open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/30309Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082022-09-06T11:17:36Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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