Modelagem matemática da hidrólise de oligômeros de glucose por uma beta-amilase processiva usando o método Fingerprinting

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mello, Gerson Ritzmann de
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/60667
Resumo: Orientadora : Prof. Dr. David Alexander Mitchell
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Quando os substratos são várias ordens de grandeza maiores que a enzima, como ocorre na hidrólise de polissacarídeos, as probabilidades de ataque processivo e a especificidade da enzima por moléculas de diferentes tamanhos pouco variam. Porém, quando a hidrolase está agindo em oligossacarídeos, a determinação destes parâmetros torna-se interessante, pois a enzima tem valores para estes parâmetros que são signficativamente diferentes para substratos que diferem no grau de polimerização por poucas unidades. A vantagem de se conhecer as constantes de especificidade relativas e as probabilidades de ataque processivo é que elas podem ser aplicadas em modelos matemáticos da reação de hidrólise que serviriam, por exemplo, para dimensionar biorreatores, para otimizar bioprocessos em uma biorrefinaria ou, ainda, para guiar experimentos de mutação em hidrolases, onde estes parâmetros seriam considerados na seleção do mutante desejado para ser submetido a novas rodadas de mutação. Entretanto, ainda não há um modelo matemático que seja válido para toda a extensão da reação de hidrólise, nem métodos que extraiam estes parâmetros simultaneamente a partir de perfis completos de hidrólise. Nos modelos disponíveis na literatura, os autores assumiram simplificações que os tornam válidos apenas para frações específicas da reação ou dificultam sua aplicação para sistemas mais complexos. O objetivo desta dissertação de mestrado foi, portanto, expandir o método Fingerprinting para extrair, além das constantes de especificidade relativas, as probabilidades de ataque processivo de perfis de hidrólise de oligossacarídeos lineares e elaborar modelos corretos para representar reações com processividade. A eficiência desta adaptação do método Fingerprinting foi comprovada pela sua aplicação em três estudos de caso de ?-amilases hidrolisando maltooligossacarídeos, de complexidade crescente, utilizando dados experimentais retirados da literatura. O primeiro estudo de caso trata da hidrólise de maltoheptaose, o sistema mais simples onde se pode observar processividade. O segundo estudo de caso foi desenvolvido sobre resultados da hidrólise de maltooctaose, um sistema com duas possíveis etapas processivas, onde o produto final da extremidade redutora é o mesmo produto removido da extremidade não-redutora pela enzima após cada ataque, o que exige uma outra abordagem para calcular a fração de hidrólise. O terceiro estudo de caso aborda a hidrólise de maltoundecaose, um sistema com três possíveis etapas processivas, onde o modelo foi ajustado a mais de um perfil de hidrólise simultaneamente. Como resultados deste trabalho, foram desenvolvidos modelos matemáticos conceitualmente corretos e válidos para toda a extensão da reação, em função do tempo e da fração de reação, para sistemas onde uma exoenzima hidrolisa um oligômero linear de forma processiva. Obteve-se, também, um método para se determinar constantes de especificidades relativas e probabilidades de ataque processivo que é mais simples de se aplicar do que outros métodos disponíveis na literatura, pois exige um número menor de experimentos. Palavras-chave: Processividade. Constantes de especificidade. Modelagem matemática. Fingerprinting. Hidrolases.Abstract: Processive action can be observed in many enzymes involved in the saccharification of polysaccharides. The probabilities of processive action, as well as the specificity constants, vary according to the size of the substrate. When substrates are several orders of magnitude larger than the enzyme, as occurs in polysaccharide hydrolysis, the probabilities of processive action and the specificity constants of the enzyme for molecules of different sizes do not vary much. However, when the hydrolase is acting on oligosaccharides, the determination of these parameters becomes interesting, since the enzyme has significantly different values of these parameters for substrates that differ in degree of polymerization by only a few units. The advantage of knowing the relative specificity constants and the probabilities of processive action is that they can be applied in mathematical models of the hydrolysis reaction that would serve, for example, to size bioreactors, to optimize bioprocesses in a biorefinery or to guide mutagenesis experiments in hydrolases, where these parameters would be considered in the selection of the desired mutant to undergo further rounds of mutation. However, prior to the current work, there was no valid mathematical model that described the full extent of the hydrolysis reaction, nor any method to extract the parameters simultaneously from complete hydrolysis profiles. In the models that were available in the literature, the authors made simplifying assumptions that limited the models to describing specific fractions of the reaction or prevented their application in more complex systems. The objective of this work was, therefore, to expand the Fingerprinting method to extract both relative specificity constants and the probabilities of processive action from hydrolysis profiles of linear oligosaccharides and to elaborate correct models to represent reactions with processivity. The suitability of this adaptation of the Fingerprinting method was proven by its application in three case studies of increasing complexity involving ?-amylases hydrolysing maltooligosaccharides, using experimental data from the literature. The first case study deals with the hydrolysis of maltoheptaose, the simplest system in which processivity can be observed. The second case study involves the hydrolysis of maltooctaose, a system with two possible processive steps, where the end product of the reducing end is the same product as that removed from the non-reducing end by the enzyme in each attack, which requires a different approach to calculating the fractional reaction extent. The third case study addresses the hydrolysis of maltoundecaose, a system with three possible processive steps, where the model was fitted to more than one hydrolysis profile simultaneously. In this work, conceptually correct mathematical models were developed, being valid for the entire extent of the reaction, as functions of time and of fractional reaction extent, for systems where an exoenzyme hydrolyzes a linear oligomer processively. A method was also obtained to determine relative specificity constants and probabilities of processive action that is simpler to apply than other methods available in the literature, since it requires a smaller number of experiments. Key-words: Processivity. Specificity constants. Mathematical model. Fingerprinting. Hydrolases.88 f. : il.application/pdfDisponível em formato digitalBioquímicaHidroliseGlicoseAmilaseModelagem matemática da hidrólise de oligômeros de glucose por uma beta-amilase processiva usando o método Fingerprintinginfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - GERSON RITZMANN DE MELLO.pdfapplication/pdf2426317https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/60667/1/R%20-%20D%20-%20GERSON%20RITZMANN%20DE%20MELLO.pdfe63b09b7d7195363208e38a09bcb093eMD51open access1884/606672019-05-10 09:42:16.82open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/60667Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082019-05-10T12:42:16Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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