Avaliação imunoquímica do anticorpo monoclonal mAb3 e da ativação do sistema complemento em diferentes isolados de Acanthamoeba

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lima, Michele Martha Weber
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/54669
Resumo: Orientadora: Profª. Drª. Larissa Magalhães Alvarenga
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spelling Costa, Adriana OliveiraMoura, Juliana Ferreira de, 1975-Ramirez, Marcel IvanUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e PatologiaAlvarenga, Larissa MagalhãesLima, Michele Martha Weber2023-01-26T20:21:41Z2023-01-26T20:21:41Z2017https://hdl.handle.net/1884/54669Orientadora: Profª. Drª. Larissa Magalhães AlvarengaCoorientadores: Profª. Drª Adriana Oliveira Costa, Profª. Drª. Juliana Ferreira de Moura e Profº. Drº. Marcel RamirezDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 01/09/2017Inclui referênciasResumo: O aumento da ocorrência de casos clínicos de ceratite amebiana (CA), grave infecção da córnea causada por amebas do gênero Acanthamoeba, tem levado a um crescente número de estudos sobre esse microrganismo. As amebas desse gênero são protozoários de vida livre, encontrados em diversos ambientes como ar, solo e água e são denominados anfizóicos, por sua capacidade de viver livremente no ambiente e de facultativamente causar infecções em animais e no ser humano. Atualmente, são admitidos diferentes genótipos de Acanthamoeba e alguns estudos demonstram relação entre o potencial de infecção e patogenicidade. Porém, fatores associados ao hospedeiro, como a interação do protozoário com o sistema imune, também tem sido avaliados como possível explicação para a ocorrência das infecções. Outra lacuna importante no conhecimento sobre as infecções por Acanthamoeba é a dificuldade no diagnóstico devido à similaridade com outras doenças, resultando em condutas clínicas inadequadas que agravam os casos. Recentemente nosso grupo produziu um anticorpo monoclonal, denominado mAb3, que apresentou reatividade por uma proteína que pode estar associada com potencial patogênico. O objetivo deste estudo é caracterizar os antígenos reconhecidos pelo mAb3, avaliar a importância desse antígeno no mecanismo de patogenicidade da CA e empregar este anticorpo na detecção de Acanthamoeba. No presente trabalho a reatividade do mAb3 foi avaliada por Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , eletroforese SDS-PAGE, Western blotting e citometria de fluxo. Foi observado diferenças na expressão do antígeno alvo para diferentes isolados. Outros agentes também causadores de ceratite foram testados e não foram reconhecidos, confirmando a especificidade do mAb3. Foi possível identificar uma pequena quantidade de amostra de trofozoítos por citometria de fluxo, demonstrando uma alta reatividade do anticorpo. Dessa forma, seria possível melhorar a sensibilidade e tempo dos testes atualmente empregados para identificação de isolados com o uso deste anticorpo. O reconhecimento pelo mAb3 é influenciado pela inibição de N-glicosilações. A identificação da proteína alvo por espectrometria de massas sugeriu ser uma proteína transportadora de membrana da família CPA2. Foram observadas diferenças em relação à lise mediada pelo sistema complemento nos isolados analisados. Dois deles (AP2 e R2P5), com variações no reconhecimento pelo mAb3, foram avaliados quanto à capacidade de ativar diferentes vias do complemento, sendo que R2P5 apresentou maior tempo de sobrevivência, após a exposição ao soro normal humano. A via alternativa foi mais ativa quando as vias da Lectina e Clássica foram inibidas, sugerindo que na presença das três vias poderia existir algum efeito inibidor da via alternativa. Porém, mais estudos envolvendo a ação biológica dessa proteína, precisam ser investigadas para elucidar os mecanismos de reconhecimento do mAb3 e resistência da ativação do sistema complemento, as quais podem estar associadas a infectividade das Acanthamoeba na CA. Palavras-chave: Acanthamoeba. Citometria de fluxo. Anticorpo monoclonal. Sistema Complemento.Abstract: Increased occurrence of clinical cases of amebic keratitis (CA), a severe corneal infection caused by amoebas of the genus Acanthamoeba, has led to a growing number of studies on this microorganism. Amoebas of this genus are free-living protozoa, found in several environments such as air, soil and water and are called amphizóicos, for their ability to live freely in the environment and to cause infections in animals and in humans at will. Different Acanthamoeba genotypes are currently recognized and some studies show differences between potential for infection and pathogenicity. However, factors related to the host, such as the interaction of the protozoan with the immune system, have also been evaluated as a possible explanation for the occurrence of infections. Another important dificulty related to Acanthamoeba infections is mis-diagnosis due to the its similarity with other diseases, resulting in inadequate clinical procedures that may aggravate the infection. Recently our group produced a monoclonal antibody, called mAb3, that recognizes antigens present in pathogenic strains. The aim of this study is to characterize the antigens recognized by mAb3, to evaluate the importance of this antigen in the mechanism of CA pathogenicity and to use this antibody in the detection of Acanthamoeba. In the present work, the reactivity of mAb3 was evaluated by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), electrophoresis SDSPAGE, Western blotting and flow cytometry. The mAb3 antibody, already described in previous studies, showed reactivity to a protein that may be associated with pathogenic potential. Differences in the expression of the target antigen were observed for different isolates. Other agents also causing keratitis were tested and were not recognized, conforming to the specificity of mAb3. It was possible to identify a small amount of trophozoite sample by mAb3 by flow cytometry, demonstrating a high antibody reactivity. Using this antibody, it would be possible to improve the sensitivity and reduce the time currently needed to identify isolates. Recognition by mAb3 is influenced by the inhibition of N-glycosylations. Identification of the protein by mass spectrometry suggested it to be a membrane carrier of the CPA2 family. Differences were observed in relation to lysis mediated by the complement system in the isolates analyzed. Two of them (AP2 and R2P5), with variations in recognition by mAb3, were evaluated for the ability to activate different complement pathways, and R2P5 presented more resistance to death after exposure to normal human serum. The alternative pathway was more active when the Lectin and Classical pathways were inhibited, suggesting that in the presence of the three pathways there could be some inhibitory effect of the alternative pathway. However, further studies involving the biological action of this protein are needed to investigate and to elucidate the mechanisms of mAb3 recognition and resistance of complement system activation, which may be associated with the infectivity of Acanthamoeba in CA. Key-words: Acanthamoeba. Flow cytometry. Monoclonal antibody. Complement system.1 recurso online : PDF.application/pdfMicrobiologiaAcanthamoebaAnticorpos monoclonaisAvaliação imunoquímica do anticorpo monoclonal mAb3 e da ativação do sistema complemento em diferentes isolados de Acanthamoebainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR_D_MICHELE MARTHA WEBER LIMA.pdfapplication/pdf2165863https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/54669/1/R_D_MICHELE%20MARTHA%20WEBER%20LIMA.pdfcdb4f6749a52f647587eb63d0e9eb382MD51open access1884/546692023-01-26 17:21:41.229open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/54669Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-01-26T20:21:41Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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