Avaliação dos requisitos estruturais e sítios de ligação da molécula de heparina necessários para o estímulo da síntese do proteoglicano de heparam sulfato

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rossi, Gustavo Rodrigues, 1989-
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/62780
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade
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spelling Rossi, Gustavo Rodrigues, 1989-Lima, Marcelo Andrade deUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularTrindade, Edvaldo da Silva, 1971-2019-09-24T16:53:00Z2019-09-24T16:53:00Z2016https://hdl.handle.net/1884/62780Orientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva TrindadeCoorientador: Prof. Dr. Marcelo Andrade de LimaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 29/03/2016Inclui referências: p. 46-52Resumo: Heparina é um polissacarídeo linear e altamente aniônico, pertencente à família dos glicosaminoglicanos (GAGs). Sua estrutura química é formada por unidades repetitivas de dissacarídeos, que são compostas alternadamente por uma D-glucosamina (que pode ser N-sulfatada ou N-acetilada e 6-O-sulfatada), e um ácido urônico (L-idurônico podendo apresentar um grupamento sulfato 2-O ligado ou ácido D-glucurônico - não sulfatado). Assim, sua alta densidade de cargas negativas é decorrente dos grupamentos sulfatos e dos grupamentos carboxílicos, presentes nos ácidos urônicos. O heparam sulfato é outro GAG cuja composição química é muito similar com a molécula de heparina, porém com menor grau de sulfatação e maior quantidade de ácido D-glucurônico. Esses compostos são encontrados ligados covalentemente a proteínas, formando os proteoglicanos. O proteoglicano de heparam sulfato (PGHS), presente na superfície das células endoteliais, é responsável por manter a compatibilidade dessas com o sangue, isto é, age impedindo a coagulação sanguínea naquele local. Dessa forma, esse PGHS já possui uma característica antitrombótica. Porém, quando essas células (em cultura) são expostas à heparina exógena ocorre um aumento da síntese desse PGHS, tornando-o também mais sulfatado, e consequentemente, aumentando sua atividade antitrombótica. Dados prévios mostram que esse efeito ocorre pela interação da heparina com moléculas da matriz extracelular (MEC), o que leva a um estímulo de vias de sinalização celular que envolvem MEK/ERK. No entanto, ainda não são conhecidos os requisitos estruturais da molécula de heparina e seu(s) possível(is) sítio(s) de ligação(ões) na MEC que é(são) responsável(is) por desencadear o estímulo da síntese do PGHS. Para responder quais são os requisitos estruturais, a heparina foi submetida a modificações químicas específicas e células endoteliais foram estimuladas com essas moléculas modificadas. As heparinas N, ou 6-O ou 2- O dessulfatadas ou carboxirreduzida foram capazes de estimular a síntese do PGHS, quando comparadas com o controle, porém o estímulo foi menor do que a heparina não modificada. Já a heparina totalmente dessulfatada não estimulou a síntese. Portanto, esse estímulo não é depende exclusivamente de um grupamento sulfato em específico ou das carboxílas e sim, da quantidade de sulfato presente na heparina. Para avaliar qual(is) sitio(s) de ligação da heparina na MEC, placas previamente cobertas com a própria MEC produzida pelas células, Matrigel ou com fibronectina foram utilizadas para selecionar os possíveis alvos. As células que foram cultivadas e estimuladas sobre o Matrigel não desencadearam esse fenômeno, já as que foram cultivadas somente sobre fibronectina, foram capazes de desencadear o estímulo. Para comprovar que a fibronectina é essencial para esse evento, essa proteína foi silenciada nas células endoteliais utilizando a técnica de RNA de interferência. Quando essas células silenciadas foram estimuladas com heparina, o aumento da síntese de PGHS não ocorreu, comprovando que a fibronectina é a molécula chave da matriz extracelular que a heparina se liga e desencadeia esse fenômeno. Palavras-chave: Heparina; Proteoglicano de Heparam Sulfato; Matriz Extracelular; Fibronectina.Abstract: Heparin is a linear and highly anionic polysaccharide, belonging to the family of glycosaminoglycans (GAGs). Its chemical structure is formed of repeating units of disaccharides, which are composed alternately by D-glucosamine (which may be Nsulfated or N-acetylated and 6-O-sulfated), and uronic acid (L-iduronic may present a grouping sulfate 2-O bound or D-glucuronic acid - non sulfated). Thus, heparin high negative charges density is due to uronic acids sulfate and carboxylic groups. The heparan sulfate is another GAG whose chemical composition is very similar to heparin molecule, but with a lower degree of sulfation and greater amount of Dglucuronic acid. These compounds are found covalently linked to protein to form proteoglycans. The heparan sulfate proteoglycan (HSPG), present on the surface of endothelial cells is responsible for maintaining blood compatibility, preventing blood clotting. Thus, this HSPG already have an antithrombotic feature. When endothelial cells (in vitro) are incubated with heparin, there is an overexpression of highly sulfated HSPG. It was revealed to be dependent on heparin interaction with extracellular matrix (ECM) leading to MEK/ERK signaling pathway activation. However, the structural requirements of heparin molecule and ECM binding site(s) which is(are) responsible(s) for triggering HSPG synthesis is still unknown. In order to investigate these structural requirements, heparin was subjected to specific chemical modifications and endothelial cells were exposed to these modified molecules. Selective N, 6-O, or 2-O desulfated or carboxy-reduced heparin were able to stimulate HSPG synthesis, although less than unmodified heparin. Totally desulfated heparin did not stimulate HSPG synthesis. Therefore, this stimulus is not dependent solely on a specific sulfate or carboxyl group, but upon the amount of sulfate in heparin. To assess the heparin ECM bidding sites(s), plates previously covered with the own ECM produced by cells (endogenous), matrigel (exogenous MEC), or fibronectin were used to detect possible targets. Cells cultured over Matrigel and later stimulated did not trigger HSPG stimulus. On the other hand, those cultured over endogenous ECM and fibronectin were capable of eliciting this phenomenon. To demonstrate that fibronectin is essential to this event, this protein was silenced in endothelial cells using siRNA. When silenced cells were stimulated with heparin, the increase in HSPG synthesis did not occurred, demonstrating that fibronectin is the key extracellular matrix molecule that heparin binds to and triggers the phenomenon. Keywords: Heparin; Heparam sulfate Proteoglycan; Extracellular Matrix; Fibronectin.59 p. : il.application/pdfHeparinaMatriz extracelularFibronectinasMorfologiaAvaliação dos requisitos estruturais e sítios de ligação da molécula de heparina necessários para o estímulo da síntese do proteoglicano de heparam sulfatoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - GUSTAVO RODRIGUES ROSSI.pdfapplication/pdf5052070https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/62780/1/R%20-%20D%20-%20GUSTAVO%20RODRIGUES%20ROSSI.pdf2d1a47ccbb6e6d02aa1c96f32ff08ce8MD51open access1884/627802019-09-24 13:53:01.086open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/62780Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082019-09-24T16:53:01Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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