Otimização da imobilização de proteínas recombinantes em nanopartículas de poli-3-hidroxibutirato (PHB) por modificação da etiqueta SBD

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sampaio, André
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/87215
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza
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spelling Müller-Santos, Marcelo, 1979-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Souza, Emanuel Maltempi de, 1964-Sampaio, André2024-03-21T17:33:32Z2024-03-21T17:33:32Z2023https://hdl.handle.net/1884/87215Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaCoorientador: Prof. Dr. Marcelo Müller dos SantosDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 30/10/2023Inclui referênciasÁrea de concentração: BioquímicaResumo: Nas últimas décadas, o uso de nanopartículas (NPs) tem crescido exponencialmente em diversas áreas da biotecnologia, especialmente na vacinologia. O poliéster biológico conhecido como poli-3-hidroxibutirato (PHB) tem se destacado como um material alternativo para produção de nanopartículas devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, capacidade de funcionalização e custo acessível. Para ancorar os antígenos ao PHB, o peptídeo SBD (Substrate Binding Domain) derivado de uma PHB depolimerase pode ser utilizado como uma proteína de fusão. Entretanto, é importante observar que o conteúdo de cisteína (Cys) e o tamanho da etiqueta podem influenciar na eficácia da imobilização da proteína de interesse nas nanopartículas. Nesse contexto, o principal objetivo deste estudo foi investigar se a remoção total ou parcial de dois resíduos de Cys da cauda SBD afeta a imobilização de proteínas nas nanopartículas de PHB. Para alcançar esse objetivo, foram expressas em E. coli BL21 (DE3) quatro proteínas diferentes: sfGFP-SBD, que consiste na proteína verde fluorescente (sfGFP) fundida geneticamente à etiqueta SBD não modificada (selvagem); sfGFP-sSBD, proteína fluorescente verde (sfGFP) fundida à etiqueta SBD deletada de um resíduo de Cys e mais outros 8 resíduos de aminoácidos N-terminais; sfGFP-sSBDA, uma subvariante de sfGFP-sSBD com a substituição C487A; e sfGFP, que serviu como controle negativo. A imobilização dessas proteínas purificadas foi realizada misturando um volume fixo de NP de PHB com concentrações crescentes de proteína, sob agitação e temperatura constantes por 20 minutos. As frações não ligadas e imobilizadas foram quantificadas por ensaios de fluorescência e mensuradas através de parâmetros de isotermas de adsorção e através de estimativa de proteína no gel de SDS-PAGE por meio de densitometria de banda. Os resultados indicam que a variante sfGFP-sSBD apresenta uma eficiência de imobilização cerca de duas vezes maior em NP-PHB do que sfGFP-SBD e quase quatro vezes maior do que sfGFP-sSBDA. Esses resultados também são confirmados pelas análises de dessorção, que mostram que a mesma proteína tem menor tendência a se desprender das nanopartículas após exposição a detergentes. Portanto, concluise que a etiqueta variante sSBD demonstra uma maior afinidade de imobilização e estabilidade em comparação com as outras etiquetas testadas. Esses resultados podem ter implicações importantes para futuras plataformas de imunização que utilizam a etiqueta SBD para ancoragem em nanopartículas.Abstract: In recent decades, the use of nanoparticles (NPs) has grown exponentially in several areas of biotechnology, such as vaccinology. The biological polyester known as poly-3-hydroxybutyrate (PHB) has stood out as an alternative material for the production of nanoparticles due to its biocompatibility, biodegradability, functionalization capacity and affordable cost. To anchor antigens to the PHB, the SBD (Substrate Binding Domain) peptide derived from a PHB depolymerase can be used as a binding tag. However, it is important to note that the cysteine (Cys) content and the size of the tag can influence the effectiveness of retention of the protein of interest in the nanoparticles. In this context, the main objective of this study was to investigate whether the total or partial removal of two Cys residues from the SBD tail affects the attachment of proteins to PHB nanoparticles. To achieve this objective, four different proteins were expressed in E. coli BL21 (DE3): sfGFP-SBD, which consists of green fluorescent protein (sfGFP) genetically fused to the unmodified (wild-type) SBD tag; sfGFPsSBD, green fluorescent protein (sfGFP) fused to the SBD tag excluded from a Cys deletion plus 8 other N-terminal amino acid residues; sfGFP-sSBDA, a subvariant of sfGFP-sSBD with the C487A substitution; and sfGFP, which served as a negative control. Immobilization of these purified proteins was performed by mixing a fixed volume of PHB NP with increasing concentrations of protein, under constant stirring and temperature for 20 minutes. The unbound and immobilized fractions were quantified by fluorescence assays and measured using adsorption isotherm parameters and through protein estimation in the SDS-PAGE gel using band densitometry. The results indicate that the sfGFP-sSBD variant presents an immobilization efficiency about two times higher in NP-PHB than sfGFP-SBD and almost four times higher than sfGFP-sSBDA. These results are also confirmed by desorption analyses, which show that the same protein has a lower tendency to detach from nanoparticles after exposure to detergents. Therefore, it is concluded that the sSBD variant demonstrates a greater layer of immobilization and stability compared to the other tags tested. These results may have important implications for future immunization platforms that utilize the SBD tag for nanoparticle anchoring.1 recurso online : PDF.application/pdfNanopartículasVacinasProteínasBioquímicaOtimização da imobilização de proteínas recombinantes em nanopartículas de poli-3-hidroxibutirato (PHB) por modificação da etiqueta SBDinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - ANDRE SAMPAIO.pdfapplication/pdf8863426https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/87215/1/R%20-%20D%20-%20ANDRE%20SAMPAIO.pdf87676e780ea1d3d8c9546e5659b63e40MD51open access1884/872152024-03-21 14:33:32.864open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/87215Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-03-21T17:33:32Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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