Papel das micropartículas endoteliais na doença renal crônica
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Tese |
| Idioma: | por |
| Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPR |
| Texto Completo: | https://hdl.handle.net/1884/80757 |
Resumo: | Orientadora: Profa. Dra. Andréa Emília Marques Stinghen |
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Dalboni, Maria AparecidaUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e PatologiaStinghen, Andréa Emilia Marques, 1970-Favretto, Giane2023-01-16T19:53:19Z2023-01-16T19:53:19Z2020https://hdl.handle.net/1884/80757Orientadora: Profa. Dra. Andréa Emília Marques StinghenCoorientador: Profa. Dra. Maria Aparecida DalboniTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 11/12/2020Inclui referênciasResumo: Toxinas urêmicas, tais como p-cresil sulfato (PCS), indoxil sulfato (IS) e fosfato inorgânico (Pi), podem levar à liberação de micropartículas endoteliais (MPEs) em pacientes com doença renal crônica (DRC). As MPEs são importantes para a sinalização célula-célula, carreando informações genéticas e proteicas de sua célula de origem. O presente estudo visa compreender o mecanismo de formação de MPEs na uremia, através da exposição de células endoteliais às toxinas urêmicas PCS, IS e Pi, e a interação dessas MPEs na ativação endotelial e leucocitária. Nesse contexto, células endoteliais humanas foram cultivadas e tratadas com PCS, IS e Pi na concentração urêmica máxima (2,6 mg/L, 236 mg/L e 3 mM), expostas ainda a 2 Mi M de ionóforo de cálcio (Ca2+) para a indução da microvesiculação. A purificação das MPEs foi realizada por meio de centrifugação diferencial, enquanto a quantificação e caracterização foi por citometria de fluxo, NanoSigth e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A determinação da concentração de uso das MPEs in vitro foi realizada pelo ensaio de Alamar Blue. Avaliou-se o efeito das MPEs sobre as células endoteliais em relação à viabilidade pelo ensaio de MTT, à adesão a diferentes tipos de proteínas da matriz extracelular (MEC) pelo ensaio de adesão, à expressão de molécula inflamatória vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) por imunocitoquímica e à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) com a sonda DCFH-DA. Para analisar a migração de células endoteliais e monócitos, foi realizado os ensaios de Wound Healing e migração celular através da câmara de Boyden, respectivamente. Através dos ensaios para a caracterização das MPEs foi possível identificar a morfologia, concentração e tamanho. A concentração de uso determinado após o ensaio de Alamar Blue foi de 10 Mi g/mL de MPEs. A adesão endotelial foi comprometida de forma significativa nas células endoteliais expostas a MPEs provenientes de PCS (PcsMPE) e Fosfato inorgânico (PiMPE) (**P<0,01). A expressão de VCAM-1 pelas células endoteliais pode ser evidenciada nas células tratadas com MPEs provenientes de células controle (CtrlMPE), PCS (PcsMPE) e IS (IsMPE). Através do ensaio de Wound Healing foi possível evidenciar um aumento significativo na migração celular quando comparado células endoteliais tratadas com PcsMPE frente as tratadas com CtrlEMP (*P<0,05). Não houve diferença significativa no ensaio de migração realizado para monócitos. Também foi possível observar que as MPEs não induzem a formação de EROS em células endoteliais. Nossos dados demonstraram que a exposição do endotélio a toxinas urêmicas é capaz de liberar MPEs com concentrações e morfologias diferentes dependendo do tipo de toxina que agrediu esse endotélio. Verificamos ainda que as MPEs podem agir diminuindo a expressão de integrinas no endotélio, dificultando a sua adesão na matriz. As MPE são capazes de induzir a expressão de VCAM-1 no endotélio, sugerindo o envolvimento no processo inflamatório. Células expostas a PcsEMP migraram mais que as células expostas aos outros tratamentos, indicando que PcsEMP podem estar correlacionadas com a ativação endotelial. Por fim, verificamos que as MPEs não possuem papel significativo no estresse oxidativo. Concluímos que as MPEs podem servir como biomarcadores de lesão endotelial e do processo inflamatório, entretanto estudos adicionais devem ser realizados para desvendar os mecanismos de formação e o papel das MPEs na uremia.Abstract: Uremic toxins, such as p-cresyl sulfate (PCS), indoxyl sulfate (IS), and inorganic phosphate (Pi), can lead to the release of endothelial microparticles (EMPs) in patients with chronic kidney disease (CKD). EMPs are important for cell-cell signaling, carrying genetic and protein information from their cell of origin. The present study aims to understand the mechanism of forming EMPs in uremia through the exposure of endothelial cells to uremic toxins PCS, IS, and Pi, and the interaction of these EMPs in endothelial and leukocyte activation. In this context, human endothelial cells were cultured and treated with PCS, IS, and Pi in the maximum uremic concentration (2.6 mg/L, 236 mg/L, and 3 mM), also exposed to 2 Mi M of calcium ionophore (Ca2+) for the induction of microvesiculation. The purification of EMPs was performed by differential centrifugation, while quantification and characterization were by flow cytometry, NanoSigth, and Scanning Electron Microscopy (SEM). The determination of the concentration of use of EMPs in vitro was performed by the Alamar Blue assay. The effect of EMPs on endothelial cells concerning viability was evaluated by the MTT assay, adhesion to different types of matrix proteins by the adhesion assay, to the expression of vascular inflammatory molecule cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) by immunocytochemistry, and the production of reactive oxygen species (ROS) with the DCFH-DA probe. Wound Healing and cell migration assay through the Boyden chamber were used to analyze the migration of endothelial cells and monocytes, respectively. Through the characterization of EMPs, it was possible to identify the morphology, concentration, and size. The concentration of use determined after the Alamar Blue test was 10 Mi g/mL of EMPs. Endothelial adhesion was significantly compromised in endothelial cells exposed to EMPs from PCS (PcsEMP) and inorganic phosphate (PiEMP) (**P<0.01). The VCAM-1 expression by endothelial cells can be seen in cells treated with MPEs from control cells (CtrlEMPs), PCS (PcsEMP), and IS (IsEMP). The Wound Healing assay demonstrated a significant increase in cell migration compared to endothelial cells treated with PcsEMP compared to those treated with CtrlEMP (*P<0.05). There was no significant difference in the migration assay performed for monocytes. It was also possible to observe that EMPs do not induce the formation of ROS in endothelial cells. Our data have shown that exposure of the endothelium to uremic toxins can release EMPs with different concentrations and morphologies depending on the type of toxin that attacked this endothelium. We also found that EMPs may act by reducing the expression of integrins in the endothelium, making it difficult for them to adhere to matrix protein. EMPs can also induce VCAM-1 expression in the endothelium, suggesting involvement in the inflammatory process. Cells exposed to PcsEMP migrated more than cells exposed to other treatments, indicating that PcsEMP may be correlated with endothelial activation. Finally, we found that EMPs do not play a significant role in oxidative stress. We conclude that EMPs may be a biomarker of endothelial injury and the inflammatory process. More studies should be carried out to unveil the mechanisms of formation and the role of EMPs in uremia.1 recurso online : PDF.application/pdfParticulasEndotelinasToxinasUremiaCelulasMicrobiologiaPapel das micropartículas endoteliais na doença renal crônicainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - GIANE FAVRETTO.pdfapplication/pdf4732354https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/80757/1/R%20-%20T%20-%20GIANE%20FAVRETTO.pdf2183594bc448536d510b9fda9a586403MD51open access1884/807572023-01-16 16:53:19.597open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/80757Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-01-16T19:53:19Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false |
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