Estudo dos peptídeos pertencentes à família ICK presentes no veneno das aranhas do gênero Loxosceles

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Matsubara, Fernando Hitomi
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/43740
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
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spelling Matsubara, Fernando HitomiChaim, Olga MeiriUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularVeiga, Silvio Sanches, 1962-2019-02-06T19:14:52Z2019-02-06T19:14:52Z2015https://hdl.handle.net/1884/43740Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaCoorientador : Profª. Drª. Olga Meiri ChaimTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2015Inclui referências : f. 102-115Área de concentraçãoResumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados peptídeo ICK ou notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a peptídeos ICK previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3, por exemplo, foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas; as sequências relativas aos demais grupos de peptídeos ICK, LiTx1, LiTx2 e LiTx4 representaram 6,2%, 11,4% e 3,8% de todos os transcritos codificantes de toxinas, respectivamente. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos ICK os objetivos deste trabalho foram o rastreamento de sequências codificantes de peptídeos ICK em outras duas aranhas do gênero (Loxosceles gaucho e Loxosceles laeta), bem como a obtenção de um peptídeo ICK semelhante à LiTx3 de forma recombinante em Pichia pastoris e sua caracterização biológica. A partir do RNA total extraído das glândulas de veneno de L. laeta e L. gaucho, procedeu-se o rastreamento de sequências relacionadas a peptídeos ICK; sequências codificantes para todos os grupos de peptídeos ICK já descritos (LiTx1-4) foram encontradas, algumas revelando sutis diferenças na sua estrutura primária, outras revelando divergências importantes como a não presença de sequências consenso para modificações pós-traducionais importantes para a atividade biológica dos mesmos. Quanto à produção do peptídeo recombinante, várias formas foram obtidas; entretanto, análises de SDS-PAGE e western blotting mostraram que os peptídeos obtidos ou não apresentavam a conformação nativa ou apresentavam glicosilação indesejada. A atividade biológica desses peptídeos foi testada in vivo em insetos e in vitro em cultura de células, contudo nenhum efeito tóxico pode ser comprovado. As sequências encontradas em L. laeta e L. gaucho representam potenciais moléculas a serem exploradas do ponto de vista biotecnológico, ao passo que o peptídeo recombinante estudado deve ser expresso em outros modelos com intuito de obtê-lo em conformação adequada e, assim, comprovar sua atividade biológica. Palavras-chave: Peptídeo ICK, notinas, Loxosceles, veneno, Pichia pastoris.Abstract: The whole content of Loxosceles spider venom still remains unknown, but several studies have shown that is a complex mixture of biologically active and inactive components. By eletrophoretic analysis, the predominance of low molecular mass molecules (3-45kDa) can be observed, while high molecular mass ones are less abundant. Spider venoms are functionally related to defense against predators as well as to paralyze and capture a natural prey, especially insects. Spiders had developed an arsenal of insecticidal molecules, resulting in a combinatorial peptide library of peptides that has been improved during evolution. Commonly, such peptides consist in single chain molecules ranging between 3- 10 kDa and are rich in cystein residues, which form intramolecular disulfide bridges. These bridges establish a structural motif "Inhibitor Cystine Knot" (ICK), then, these peptides are named ICK peptides or "knottins". Recently, a transcriptome analysis of L. intermedia venomous gland (GREMSKI et al., 2010) has revealed ESTs with similarity to ICK peptides previously described as LiTx (De CASTRO et al., 2004). LiTx3-related sequences were the most abundant in the L. intermedia transcriptome representing about 13.9% of all ESTs obtained and comprise 32% of toxin-encoding messengers; the sequences related to the other groups of ICK peptides, LiTx1, LiTx2 e LiTx4, represented 6,2%, 11,4% and 3,8% of all EST coding for toxins, respectively. Due to the high proportion of sequences encoding ICK peptides verified by the transcriptome analyses, the present study aimed screening ESTs related to these peptides in other two Loxosceles species (L. gaucho and L. laeta), as well as the obtainment of an ICK recombinant peptide with high similarity to LiTx3 in Pichia pastoris and its biological activity characterization. From total RNA purified from the venom glands of L. gaucho and L. laeta, it was performed the screening of ICK peptides sequences. ESTs coding for all groups of ICK peptides already described were found (LiTx1-4), some of them revealed subtle differences in their primary structures while others showed important divergences, for example, the absence of consensus sequences for posttranslational modifications that are essential for biological activities. The recombinant peptide was produced in different forms, however, SDS-PAGE and western blotting analyses indicated that they were not properly folded or presented unwanted glycosylation. The biological activity of the recombinant peptide was tested in insects microinjection's assays and in vitro cultivated cells, nevertheless no toxic effects were proven. The sequences identified form L. laeta and L. gaucho RNA represent potential molecules to be biotechnologically explored, whereas the studied recombinant peptide must be expressed in other heterologous expressions models in order to obtain it in the native conformation and, thus, verify its biological activity. Keywords: ICK peptides, knottins, Loxosceles, venom, toxins, Pichia pastoris. recombinant peptide was tested in insects microinjection's assays and in vitro cultivated cells, nevertheless no toxic effects were proven. The sequences identified form L. laeta and L. gaucho RNA represent potential molecules to be biotechnologically explored, whereas the studied recombinant peptide must be expressed in other heterologous expressions models in order to obtain it in the native conformation and, thus, verify its biological activity. Keywords: ICK peptides, knottins, Loxosceles, venom, toxins, Pichia pastoris.116f. : il. algumas color.application/pdfDisponível em formato digitalCitologia e biologia celularBiologia molecularAranha - VenenoPeptídeosPichia stipitisEstudo dos peptídeos pertencentes à família ICK presentes no veneno das aranhas do gênero Loxoscelesinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessTHUMBNAILR - T - FERNANDO HITOMI MATSUBARA.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1318https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/43740/1/R%20-%20T%20-%20FERNANDO%20HITOMI%20MATSUBARA.pdf.jpg7eae366b21684fdbc30441c2024864e8MD51open accessTEXTR - T - FERNANDO HITOMI MATSUBARA.pdf.txtExtracted Texttext/plain509642https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/43740/2/R%20-%20T%20-%20FERNANDO%20HITOMI%20MATSUBARA.pdf.txt4cff2a1e223b9889ca2a76f94bd6306fMD52open accessORIGINALR - T - FERNANDO HITOMI MATSUBARA.pdfapplication/pdf7231933https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/43740/3/R%20-%20T%20-%20FERNANDO%20HITOMI%20MATSUBARA.pdf24e16d4c55efea404b6b80c12f555934MD53open access1884/437402019-02-06 17:14:52.469open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/43740Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082019-02-06T19:14:52Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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