Demonstração da prova de conceito de um teste portátil para detecção de Plasmodium spp. através de PCR em tempo real

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Ana Cláudia Graziani
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/41385
Resumo: Orientador : Marco A. Krieger
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spelling Costa, Alexandre Dias TavaresUniversidade Federal do Paraná. Setor de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaKrieger, Marco AurelioSilva, Ana Cláudia Graziani2024-04-11T12:29:30Z2024-04-11T12:29:30Z2014https://hdl.handle.net/1884/41385Orientador : Marco A. KriegerCoorientador : Alexandre Dias T. CostaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 04/07/2014Inclui referências : f.69-82Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: A malária é uma doença que afeta milhões de pessoas no mundo. O parasito Plasmodium spp., agente etiológico da malária, pode ser transmitidos através de picadas de mosquitos, transfusão de sangue, compartilhamento de seringas ou no nascimento. Atualmente, o diagnóstico da malária baseia-se na identificação de parasitos em esfregaços de sangue por meio de microscopia óptica (método de gota espessa) ou detecção de resposta imunológica do hospedeiro humano. O diagnóstico de gota espessa pode não destinguir entre as espécies de Plasmodium spp. morfologicamente semelhantes, sendo, portanto, limitado para os estudos epidemiológicos. Os testes moleculares começaram a ser utilizados para a detecção simultânea de duas ou mais espécies de Plasmodium spp. em uma única reação. Neste trabalho, foi desenvolvido uma reação de PCR em Tempo Real quantitativa (qPCR) em um chip de silício, usando um microrreator que funciona como termociclador portátil com detectores de fluorescência chamado Q3. Os resultados do qPCR no chip são comparáveis com os resultados obtidos com equipamentos qPCR padrão (ABI7500). Tanto a PCR em Tempo Real no ABI7500 quanto a PCR em Tempo Real no chip (Q3) foram capazes de amplificar todas as amostras testadas, com o limite de detecção em 1,5 parasitas/microlitro de sangue com Ct de 33,5 na plataforma Q3 e Ct 35,4 na plataforma ABI7500. Utilizando como comparação a detecção de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax e Plasmodium malariae em equipamentos padrão, os resultados obtidos na plataforma Q3 demonstram a funcionalidade de um teste qPCR portátil para detecção e diferenciação destas espécies. Considerando as conhecidas dificuldades de transporte e estocagem dos testes moleculares com relação à manutenção da temperatura, aplicou-se a tecnologia da gelificação no teste em estudo, tornando-o possível de ser estocado a 4 oC por 24 horas sem perda de sensibilidade. Os resultados aqui apresentados são o primeiro passo para o desenvolvimento de um teste portátil, rápido, sensível e específico de diagnóstico para a malária, trazendo soluções de alta tecnologia a um passo de estar disponível para as populações negligenciadas.Abstract: Malaria is a disease that affects millions of people worldwide. The parasite Plasmodium spp., the etiologic agent of malaria, can be transmitted through mosquito bites, blood transfusion, sharing needles or at birth. Currently, the diagnosis of malaria is based on the identification of parasites in blood smears, by detection of host immune response or by optical microscopy (thick film method). The thick blood diagnosis method might not be able to distinguish between the species of Plasmodium spp. which are morphologically similar, and therefore it has limited application to epidemiological studies. Molecular tests began to be used for the simultaneous detection of two or more species of Plasmodium spp. in a single reaction. In this work, we developed a reaction of quantitative Real-Time PCR (qPCR) on a silicon chip, using a microreactor as a portable thermocycler with fluorescence detectors called Q3. The qPCR results on the chip are comparable to those obtained with a standard qPCR equipment (ABI7500). Both real-time PCR in ABI7500 as the Real-Time PCR chip (Q3) were able of amplifying all samples tested, with a lower detection limit of 1.5 parasites/microliter of blood at a Ct of 33.5 in the Q3 platform and 35.4 in the ABI7500 platform. Comparing the detection Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Plasmodium malariae on a standard equipment, the results obtained with the Q3 platform demonstrate the functionality of a portable qPCR assay to detect and differentiate these species. The reaction developed in this work also detected a human gene as an internal reaction control. Considering the known difficulties for transport and storage of molecular tests with respect to the maintenance of temperature, we applied a gelification technology to our qPCR, making it possible to be stored at 4 oC for 24 hours without loss of sensitivity. Results presented here are the first step towards the development of a portable, rapid, sensitive and specific molecular diagnostic test for malaria, bringing high technology solutions one step closer to being available for neglected populations.82 f. : il. algumas color., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalBiotecnologiaMalariaDoenças transmissíveisDemonstração da prova de conceito de um teste portátil para detecção de Plasmodium spp. através de PCR em tempo realinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - ANA CLAUDIA GRAZIANI SILVA.pdfapplication/pdf1713973https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41385/1/R%20-%20D%20-%20ANA%20CLAUDIA%20GRAZIANI%20SILVA.pdf4a54df2e09a9ad39d59f2526efbb26f8MD51open accessTEXTR - D - ANA CLAUDIA GRAZIANI SILVA.pdf.txtExtracted Texttext/plain150015https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41385/2/R%20-%20D%20-%20ANA%20CLAUDIA%20GRAZIANI%20SILVA.pdf.txtd50adf408a15fb4e64534c19ea852aabMD52open accessTHUMBNAILR - D - ANA CLAUDIA GRAZIANI SILVA.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1260https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/41385/3/R%20-%20D%20-%20ANA%20CLAUDIA%20GRAZIANI%20SILVA.pdf.jpgca30a36c144a99fd55e0974c705c56dbMD53open access1884/413852024-04-11 09:29:30.748open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/41385Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-04-11T12:29:30Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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