Caracterização da interação da proteína Adam23 com a proteina Prion Celular e avaliação da função biológica desta interação

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Michele Dietrich Moura
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/25996
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata
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spelling Costa, Michele Dietrich MouraMercadante, Adriana FrohlichUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularZanata, Silvio Marques2018-04-20T18:08:39Z2018-04-20T18:08:39Z2010http://hdl.handle.net/1884/25996Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques ZanataCo-Orientador: Profa. Adriana F. MercadanteTese(doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba,05/08/2010Bibliografia; fls. 131-142Resumo: ADAM23 é uma proteína transmembrana, membro da família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), expressa predominantemente no sistema nervoso central tanto no desenvolvimento quanto na fase adulta. Camundongos nocautes para Adam23 desenvolvem tremores e ataxia e não sobrevivem mais do que duas semanas após o nascimento, sugerindo que ADAM23 possui um importante papel no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel fisiológico desta proteína. Interessados nas possíveis funções desempenhadas por ADAM23 no sistema nervoso decidiu-se investigar interações desta proteína com outras moléculas. Foi descrito que ADAM23 está presente nos mesmos micro-domínios de membrana ou na vizinhança onde a proteína príon celular (PrPC) é encontrada. PrPC é uma proteína associada à membrana por âncora de glicosilfosfatidilinositol encontrada nos microdomínios de membrana ricos em colesterol e glicoesfingolipídeos, os lipid rafts. PrPC também é amplamente expresso no sistema nervoso central e está envolvido numa série de doenças neurodegenerativas. Sendo assim, o presente trabalho teve como interesse principal estudar a interação entre ADAM23 e PrPC e investigar seus possíveis papéis biológicos. Inicialmente, foram produzidas ferramentas necessárias para o estudo de ADAM23. Domínios recombinantes dessa proteína foram obtidos e puderam ser empregados na imunização de coelhos para a obtenção de anticorpos policlonais. Estes últimos não foram obtidos com sucesso. Para contornar o problema da falta de anticorpos específicos anti-ADAM23, células que superexpressavam ADAM23 fusionada à etiqueta de hemaglutinina (HA) foram usadas nos diversos ensaios e, dessa forma, ADAM23 pôde ser marcada com anticorpos anti-HA. Os ensaios de co-imunoprecipitação e ligação demonstraram que ADAM23 interage in vitro com PrPC. O ensaio de ligação também sugeriu que esta interação pode ser direta e que o domínio desintegrina possuí um sítio potencial de ligação para PrPC. As análises de amostras de lipid rafts de diferentes linhagens celulares que superexpressam ADAM23-HA demonstraram que esta proteína não é uma molécula encontrada nestes microdomínios. No entanto, quando PrPC foi superexpresso, ADAM23 apresentou um deslocamento para as regiões de lipid rafts. Sabendo que estes microdomínios estão envolvidos na endocitose de PrPC, resolveu-se investigar se a interação com ADAM23 teria algum papel neste processo fisiológico. Os resultados de endocitose de PrPC mediada por cobre demonstraram que a presença de ADAM23 diminui a endocitose de PrPC em células HEK 293T. Estes dados sugerem um novo papel biológico para ADAM23 na modulação do tráfego celular de PrPC.Abstract: ADAM23 is a transmembranic protein, member of ADAMs family, predominantly expressed in the central nervous system. ADAM23 is expressed during initial development and also during adulthood. Adam23 knockout mice develop shivers and ataxia and die in less than two weeks after birth. These observations suggest that ADAM23 plays an important role in the development and maintenance of the central nervous system. However, the physiological role of ADAM23 remains unclear. In order to elucidate some functions played by ADAM23, we decided to investigate the interactions between this protein and other molecules. Previous studies show that ADAM23 is present in the same membrane microdomains as the cellular prion protein (PrPc). PrPC is a glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein attached to the plasma membrane. It is encountered on membrane microdomains rich on cholesterol and glycosphingolipid, termed lipid rafts. PrPC is also broadly expressed in the central nervous system. It has been shown that PrPc is involved in neurodegenerative diseases. The aim of this work was to study the interaction between ADAM23 and PrPC and putative biological roles for this interaction. Firstly, it was necessary to produce some specific tools for ADAM23. Recombinant proteins were produced and used to immunize rabbits to obtain polyclonal antibodies. Nevertheless, the animals failed to produce antibodies against ADAM23. To overcome this problem, cells that overexpressed ADAM23 HA tagged were used in the assays. Co-immunoprecipitation and binding assays showed that ADAM23 can interact in vitro with PrPC. Binding assays also suggest that this interaction is direct and that the disintegrin domain of ADAM23 is able to interact with PrPC. Lipid rafts analysis showed that ADAM23-HA overexpressed by different cells was always found outside the rafts. However, ADAM23 moved to the rafts when PrPC was overexpressed. Since lipid rafts are involved in PrPC endocytosis, we decided to analyze whether ADAM23 could participate in PrPC endocytosis. The copper-induced endocytosis of PrPC in HEK 293T was decreased when ADAM23 was overexpressed. These findings suggest a novel role for ADAM23 in cellular trafficking modulation of PrPC.257f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesProteínasCelulas - InteraçaoCitologia e biologia celularBiologia molecularCaracterização da interação da proteína Adam23 com a proteina Prion Celular e avaliação da função biológica desta interaçãoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALTese Doutorado Michele Dietrich Moura Costa 2010.pdfapplication/pdf15543163https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/25996/1/Tese%20Doutorado%20Michele%20Dietrich%20Moura%20Costa%202010.pdf5966753a01a326ef8e848b6775b43103MD51open accessTEXTTese Doutorado Michele Dietrich Moura Costa 2010.pdf.txtExtracted Texttext/plain303271https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/25996/2/Tese%20Doutorado%20Michele%20Dietrich%20Moura%20Costa%202010.pdf.txt94f7454becb9445b9620ab8f1afb0b9cMD52open accessTHUMBNAILTese Doutorado Michele Dietrich Moura Costa 2010.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1350https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/25996/3/Tese%20Doutorado%20Michele%20Dietrich%20Moura%20Costa%202010.pdf.jpgec6b98ace539edc786ba0c2a9cb288a5MD53open access1884/259962018-04-20 15:08:39.386open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/25996Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082018-04-20T18:08:39Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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