Construção de um controle interno derivado de bacteriófago para utilização em um teste de detecção do vírus da Hepatite C baseado em PCR em tempo real

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Zambenedetti, Miriam Ribas
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/63348
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger
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spelling Pavoni, Daniela ParadaUniversidade Federal do Paraná. Setor de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaKrieger, Marco AurelioZambenedetti, Miriam Ribas2024-04-11T12:23:23Z2024-04-11T12:23:23Z2010https://hdl.handle.net/1884/63348Orientador : Prof. Dr. Marco Aurélio KriegerCoorientadora : Profa. Dra. Daniela Parada PavoniDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba,13/04/2010Bibliografia: fls. 178-185Resumo: A hepatite C hoje representa um sério problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Pelo menos 3% da população mundial está infectada. Dos casos existentes, 15% são curados e 85% tornam-se crônicos. 20% dos crônicos evoluem para cirrose hepatica e 4% para formas mais graves de doenças do fígado. Não há vacinas disponíveis e os tratamentos usados são de eficácia limitada. Desta forma um diagnóstico correto é essencial e somente a utilização de técnicas bem padronizadas e monitoradas com controles internos podem trazer esta garantia e assegurar a interpretação conclusiva dos achados obtidos evitando a liberação de resultados falso-positivos ou falso-negativos que podem comprometer um diagnóstico final. Baseando-se nestas informações foi feita a proposta deste trabalho cujo objetivo principal foi o desenvolvimento de um controle interno derivado de um bacteriófago estável e não infeccioso para um teste de detecção do vírus da hepatite C baseado em PCR em tempo real. Este controle por ser um vírus RNA como o HCV, pode controlar a metodologia desde a extração até a amplificação. Na construção desse controle foi utilizado o RNA comercial do bacteriófago MS2. O genoma inteiro do fago amplificado por PCR foi inserido no plasmídeo pGEM®-T Easy originando o pGEM®-T Easy - MS2, cuja clonagem produziu quantidade suficiente do genoma para a contrução do pET-47b(+) - MS2. Neste plasmídeo foi inserido, no gene da replicase do MS2, uma sequência sintética com 144 bases derivada da região 5' UTR do HCV originando o pET-47b(+) - MS2 - SS. Nesta sequência algumas bases foram alteradas permitindo o desenho de uma sonda para distinguir na PCR em tempo real o controle interno do HCV. Este plasmídeo foi transformado na bactéria BL21(DE3)pLyS e foi usado para expressar o bacteriófago MS2 recombinante que é o controle interno competitivo (CIC). Simultaneamente, expressou-se o MS2 a partir do vetor pET-47b(+) - MS2 que serviu como padrão na quantificação do M 2 recombinante e que também foi testado como um controle nterno não competitivo na PCR em Tempo Real. Padronizou-se reações multiplex "two step" e "one step" para as combinações CIC/HCV usando os mesmos "primers" para amplificar o HCV e o CIC e sondas para distinguir os dois alvos. Para as combinações MS2/HCV utilizou-se "primers" e sondas específicas para cada um dos alvos. Foram estudadas diversas concentrações destes controles e definiu-se que 0,025 PFU eq. do CIC e 0,1 PFU do MS2 são as quantidades ideais para serem adicionadas à amostra clínica antes de extração do RNA, porque não interferem na detecção de amostras com cargas virais altas e baixas. Foram conduzidos também estudos para avaliar-se a estabilidade e verificou-se que a estocagem a 4ºC tanto do CIC como do MS2 garante a manutenção da carga viral ao longo do tempo analisado. Portanto o presente trabalho mostrou a viabilidade técnica do desenvolvimento e da utilização de dois controles internos em uma metodologia diagnóstica e abriu perspectivas para a criação de novos controles, uma vez que os plasmídeos construídos podem servir como base para o desenvolvimento de controles específicos para metodologias diagnósticas de outras doenças causadas por vírus RNA.Abstract: Hepatitis C is a serious public health problem in Brazil and in the world. At least 3% of world population is infected, there is no vaccine available and the treatment used is of limited effectiveness. Around 85% of patients evolve to chronic phase, 20% of them develop liver cirrhosis and 4% other serious hepatic diseases. In this way a diagnostic tool with high sensitivity and specificity and quality control measures are instruments to ensure the correct interpretation of the diagnosis and prevention of false positives and false negatives results. Therefore the main objective of this work was to develop a stable internal control derived from non-infectious bacteriophage for hepatitis C virus detection test based on real-time PCR. This control is a RNA virus that can control the methodology from extraction to amplification. In the construction of this control it was used a commercial bacteriophage MS2 RNA. The entire genome of the phage amplified by PCR was inserted into plasmid pGEM®-T Easy resulting in the pGEM®-T Easy - MS2, which produced enough genome for the construction of pET-47b(+) - MS2. It was inserted into the MS2 replicase gene a synthetic sequence of 144 bases derived from 5' UTR region of HCV resulting in the pET-47b(+) - MS2 - SS. In this sequence a few bases were exchanged allowing the design of a probe to distinguish in the real-time PCR the internal control from HCV. This plasmid was transformed in E. coli BL21(DE3)pLyS that expressed the recombinant bacteriophage MS2, the competitive internal control (CIC). At the same time the wild type MS2 was expressed from the pET-47b(+) - MS2 and used as the standard quantification of recombinant MS2 (CIC). Wild type MS2 was also tested as a non-competitive internal co trol in real-time PCR. Multiplex reactions "two step" and "one step" were standardized for combinations of CIC/HCV using the same primers to amplify the HCV and CIC and probes to distinguish the two targets. For the combination MS2/HCV we used primers and probes specific for each target. We studied different concentrations of these controls and set 0.025 PFU eq. of CIC and 0.1 PFU of MS2 as the ideal amount for be added to the clinical sample prior to extraction because they do not interfere with the detection of high and low viral loads samples. We conducted studies to evaluate the stability of phage solution and found that the storage at 4°C of both CIC and the MS2 ensures the viral load maintence over the assessed time. Therefore this study has demonstrated the technical feasibility of the development and use of two internal controls in a diagnostic method and allows the creation of other controls since the plasmids may serve as a basis for developing controls for specific diagnostic methods for other RNA viral diseases.185f. : il. [algumas color], grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalBacteriofagosHepatite por vírusDiagnostico virologicoTecnologia químicaConstrução de um controle interno derivado de bacteriófago para utilização em um teste de detecção do vírus da Hepatite C baseado em PCR em tempo realinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - MIRIAM RIBAS ZAMBENEDETTI.pdfapplication/pdf8051366https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/63348/1/R%20-%20D%20-%20MIRIAM%20RIBAS%20ZAMBENEDETTI.pdf4c007c02cc401255948f9827a2efb368MD51open access1884/633482024-04-11 09:23:23.493open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/63348Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-04-11T12:23:23Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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