Estrutura química e atividade antitumoral de heteroramnanas sulfatadas nativas e modificadas quimicamente obtidas da alga verde Gayralia brasiliensis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mazepa, Ester
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/70884
Resumo: Orientador : Profª. Drª. Maria Eugênia Duarte Noseda
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spelling Noseda, Miguel Daniel, 1962-Winnischofer, Sheila Maria Brochado, 1976-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Duarte, Maria Eugênia Rabello, 1955-Mazepa, Ester2023-01-20T16:03:32Z2023-01-20T16:03:32Z2017https://hdl.handle.net/1884/70884Orientador : Profª. Drª. Maria Eugênia Duarte NosedaCoorientadores : Prof. Dr. Miguel Daniel Noseda ; Profª. Drª. Sheila M. B. WinnischoferTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 06/12/2017Inclui referências: f. 199-213Resumo: Polissacarídeos sulfatados sintetizados por algas marinhas apresentam grande variedade de atividades biológicas, como antiviral, anticoagulante e antitumoral. As diferentes características estruturais entre eles representam importantes ferramentas para o estudo das relações estrutura-atividade biológica. Modificações químicas que promovam o aumento do teor de grupos sulfato nestes polímeros melhoram significativamente seus efeitos biológicos. O objetivo deste trabalho foi determinar a estrutura química fina de heteroramnanas sulfatadas nativas e oversulfatadas obtidas da alga verde Gayralia brasiliensis e avaliar seus efeitos citotóxicos em células tumorais humanas de glioblastoma (linhagem U87MG) e melanoma (linhagem WM9). A alga seca e moída foi submetida a 4 extrações aquosas sequenciais (80°C, 4 h) originando as frações Gb1 a Gb4. Análises químicas e espectroscópicas demonstraram que estas frações são constituídas por heteroramnanas sulfatadas. A fração Gb1 (33% de rendimento, 29,3% de grupos sulfato) foi purificada por ultrafiltração em membrana (cutoff 300 kDa), originando uma fração homogênea em relação à massa molecular denominada Gb1r (33,4% de rendimento, Mw 1,371 x 106 g.mol-1). Análises de metilação, dessulfatação e trideuteriometilação demonstraram que as frações Gb1 e Gb1r apresentam estrutura química constituída por cadeia principal contendo unidades de ramnose 3-ligada, 2-ligada e 2,3-dissubstituídas, em proporções de 1,00:0,52:0,08 e 1,00:0,39:0,37, respectivamente. Adicionalmente, as unidades 3- e 2-ligadas das frações Gb1 e Gb1r são monossulfatadas, dissulfatadas ou não substituídas por grupos sulfato, nas proporções de 1,0:0,53:0,31 e 1,0:0,48:0,23, respectivamente. Terminais não redutores de ácido ?-D-glucurônico dissulfatados (em C-2 e C-4) e unidades de ?-Dglucose 4-ligadas sulfatadas em C-6 foram pela primeira vez descritos para heteroramnanas sulfatadas. A fração Gb1 foi submetida à reação de sulfatação química, originando um produto oversulfatado com estrutura química inédita (Gb1-OS, 89% de rendimento, 55,4% de grupos sulfato). Análises de metilação conduzidas com a fração Gb1-OS carboxirreduzida demonstraram que houve inserção de grupos sulfato na maioria das unidades de ?-L-ramnose 3- e 2-ligadas não sulfatadas e monossulfatadas. Adicionalmente, os terminais não redutores de ?-L-ramnose e ?-D-xilose foram trissulfatados, parte dos terminais não redutores de glucose e unidades de glucose 4- ligada foram totalmente sulfatados. As unidades de ?-D-xilose 3-ligadas, assim como ?- D-galactose 3,4-dissubstituída foram totalmente sulfatadas. Análises de RMN de 1H, 13C, HSQC, COSY, TOCSY e NOESY das frações Gb1, Gb1r e Gb1-OS confirmaram os resultados de metilação. As frações Gb1 e Gb1-OS (100 ?g.mL-1) exibiram atividade citotóxica em células tumorais humanas de glioblastoma (U87MG) e melanoma (WM9), através de indução de morte celular por apoptose. Corroborando esse resultado, a fração Gb1-OS (mais citotóxica) promoveu indução de fragmentação do DNA nas duas linhagens (54% em U87MG e 31% em WM9). Adicionalmente, em glioma a fração Gb1 provoca o aumento da porcentagem de células na fase G1 do ciclo celular (13,6%), enquanto Gb1-OS provoca redução da porcentagem de células na fase G1 (26,7%), aumento nas fases S (15,3%) e G2 (11,4%). Em melanoma, não houve alteração no ciclo celular após tratamento com Gb1 e Gb1-OS. Vale ressaltar que Gb1-OS promoveu inibição da migração celular em células WM9. Nenhuma fração foi citotóxica para células normais de fibroblasto humano (linhagem MRC-5). O efeito citotóxico potencializado da fração Gb1-OS sobre as linhagens U87MG e WM9 foi correlacionado com o aumento da proporção de unidades de ?-L-ramnose dissulfatadas em relação à heteroramnana nativa de G. brasiliensis. Palavras-chave: Algas verdes. Polissacarídeos sulfatados. Oversulfatação. Estrutura química. Efeito citotóxico.Abstract: Sulfated polysaccharides biosynthesized by seaweeds present a wide range of biological activities, as antiviral, anticoagulant and antitumoral. The different chemical characteristics between them represent important tools for the study of structurebiological activity relationship. Chemical modifications that promote increasing of sulfate groups content in these polymers significantly improve their biological effects. The aim of this study was to determine fine chemical structure of native and oversulfated heterorhamnans obtained from the green seaweed Gayralia brasiliensis and evaluate their cytotoxic effect in human glioblastoma (U87MG) and melanoma (WM9) cell lines. Dried and milled seaweed was submitted to 4 sequential aqueous extractions (80°C, 4 h), giving rise to Gb1 to Gb4 fractions. Chemical and spectroscopic analyses showed that these fractions are constituted by sulfated heterorhamnans. Gb1 fraction (33% yield, 29.3% of sulfate groups) was purified by ultrafiltration (cut-off 300 kDa), giving rise to a homogeneous fraction in relation to molecular mass, named Gb1r (33.4% yield, Mw 1,371 x 106 g.mol-1). Methylation, desulfation and trideuteromethylation analyses demonstrated that Gb1 and Gb1r present chemical structure constituted by a main chain containing 3-linked, 2-linked and 2,3-disubstituted rhamnosyl units at proportion of 1,00:0,52:0,08 and 1,00:0,39:0,37, respectively. Additionally, Gb1 and Gb1r 3- and 2- linked units are monosulfated, dissulfated or no-substituted by sulfate groups at proportions of 1,0:0,53:0,31 and 1,0:0,48:0,23, respectively. Dissulfated ?-D-glucuronic acid non reducing terminals (at C-2 and C-4) and 4-linked ?-D-glucosyl units sulfated at C-6 were described for the first time in sulfated heterorhamnans. Gb1 fraction was submitted to chemical sulfation reaction, giving rise to an oversulfated product with unpublished chemical structure (Gb1-OS, 89% yield, 55.4% of sulfate groups). Methylation analyses carried out with the carboxyl-reduced Gb1-OS demonstrated that sulfate groups were inserted in most part of no-sulfated and monosulfated 3- and 2- linked ?-L-rhamnosyl units. Additionally, ?-L-rhamnose and ?-D-xylose non reducing terminals were trissulfated and part of ?-D-glucose non reducing terminals and 4-linked ?-D-glucose were totally sulfated. 3-linked ?-D-xylosyl units, as well as 3,4-disubstituted ?-D-galactosyl units were totally sulfated. 1H, 13C, HSQC, COSY, TOCSY and NOESY NMR analyses of Gb1, Gb1r and Gb1-OS confirmed methylation results. Gb1 and Gb1- OS fractions (100 ?g.mL-1) exhibited cytotoxic activity in human tumor cells of glioblastoma (U87MG) and melanoma (WM9), through apoptosis cell death induction in different proportions. Corroborating this result, Gb1-OS fraction (more cytotoxic) induced DNA fragmentation in both cell lines (54% in U87MG and 31% in WM9). Additionally, in glioma fraction Gb1 causes increasing in percentage of cells in cell cycle G1 phase (13.6%), whereas Gb1-OS causes reduction in percentage of cells in G2 phase (26.7%) and increasing of cells in S (15.3%) and G2 phases (11.4%). In melanoma, no alterations in cell cycle were observed after treatment with Gb1 and Gb1-OS. It is noteworthy that Gb1-OS promoted cell migration inhibition in WM9 cells. None of the fractions were cytotoxic to normal human fibroblast cells (MRC-5 cell line). The potentiated effect of Gb1-OS fraction on U87MG and WM9 cell lines was correlated with increasing proportions of dissulfated ?-L-rhamnosyl units when compared to native heterorhamnans from G. brasiliensis. Key-words: Green seaweeds. Sulfated polysaccharides. Oversulfation. Chemical structure. Cytotoxic Effect.213 f. : il., gráfs., tabs.application/pdfBioquímicaAlgas verdesPolissacarideosEstrutura quimicaEstrutura química e atividade antitumoral de heteroramnanas sulfatadas nativas e modificadas quimicamente obtidas da alga verde Gayralia brasiliensisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - ESTER MAZEPA.pdfapplication/pdf9692858https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/70884/1/R%20-%20T%20-%20ESTER%20MAZEPA.pdfef7ab673bd660aa1aad6d5139b0ee4f1MD51open access1884/708842023-01-20 13:03:32.446open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/70884Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-01-20T16:03:32Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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