Atividades anticoagulante e antitrombótica de polissacarídeos sulfatados e fosforilados

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Román Ochoa, Yony
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/46466
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Thales Ricardo Cipriani
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spelling Iacomini, Marcello, 1947-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Cipriani, Thales Ricardo, 1978-Román Ochoa, Yony2023-01-26T19:34:43Z2023-01-26T19:34:43Z2017https://hdl.handle.net/1884/46466Orientador : Prof. Dr. Thales Ricardo CiprianiCoorientador : Prof. Dr. Marcello IacominiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 23/02/2017Inclui referências: f. 81-86;112-119;146-150;162-173Resumo: Nesta tese são apresentados resultados de sulfatação e fosforilação química de polissacarídeos, e de avaliação de atividades anticoagulante e antitrombótica de algumas das moléculas obtidas. Um protocolo otimizado de sulfatação química foi desenvolvido e aplicado em diferentes polissacarídeos, e testes de APTT e PT foram utilizados para monitorar o processo de sulfatação. Os polissacarídeos nativos e sulfatados foram caracterizados por análises de composição monossacarídica, metilação, grau de sulfatação (DS), homogeneidade e massa molecular, além de técnicas de RMN. Primeiramente, o protocolo de sulfatação foi desenvolvido com uma fucogalactana extraída do cogumelo Agaricus bisporus, purificada e caracterizada. O método de sulfatação foi otimizado usando ácido clorosulfônico como agente sulfatante, modificando o tempo de reação, volume total da reação por massa da amostra (VT/w), e relação molar de agente sulfatante por grupo hidroxila no polissacarídeo (?ClSO3H/OH). A fucogalactana sulfatada (E100) com melhor atividade anticoagulante foi obtida com uma relação ?ClSO3H/OH de 18, VT/w de 100, em 6 horas de reação. O incremento linear entre 15 e 45 ?g mL-1 no APTT, e entre 20 e 400 ?g mL-1 no PT mostrou que a fucogalactana sulfatada tem maior atividade anticoagulante inibindo a via de contato da cascata de coagulação. Os parâmetros otimizados de sulfatação química foram implementados em um protocolo que usa sulfato de piridina como agente sulfatante, resultando em outra fucogalactana sulfatada (ESL). E100 e ESL foram avaliados quanto à capacidade de inibir os principais fatores de coagulação alvos da ação da heparina. Ambas inibiram a ?-trombina na presença dos inibidores naturais antitrombina e cofator II da heparina. ESL não inibiu o FXa na presença da antitrombina, porém teve maior inibição sobre o FXIIa comparado com E100. No entanto, ESL teve maior atividade anticoagulante nos testes de APTT, PT e TT. ESL mostrou um baixo DS (1,0) comparado com E100 (2,8) e as análises de RMN mostraram que ele teve um padrão de sulfatação mais homogêneo. Uma maior biodisponibilidade de ESL comparado com E100 pode ser a justificativa para a sua maior atividade anticoagulante. Posteriormente, uma ?-glucana extraída de A. bisporus e pectina cítrica também foram sulfatadas pelo método de sulfato de piridina, seguindo os parâmetros previamente otimizados. Análises de APTT e PT mostraram que a fucogalactana sulfatada ESL teve maior atividade anticoagulante in vitro comparada com a pectina cítrica sulfatada, enquanto a ?-glucana sulfatada apresentou menor atividade. No entanto, a pectina cítrica sulfatada teve maior atividade antitrombótica in vivo comparada com a fucogalactana sulfatada. Esses resultados indicaram que o modo de ação dos polissacarídeos sulfatados in vivo não necessariamente reflete a atividade anticoagulante in vitro. Finalmente, dois protocolos de fosforilação de polissacarídeos foram desenvolvidos, usando as condições otimizadas de sulfatação. Encontrou-se atividade anticoagulante somente para a fucogalactana fosforilada pelo método que usa H3PO4 como reagente de fosforilação e formamida-trietilamina como solvente de reação. Os resultados mostraram que a atividade anticoagulante da fucogalactana fosforilada, determinada por teste de APTT, foi cerca de 1000 vezes menor que aquelas da fucogalactana sulfatada (ESL e E100). Assim, a presença de grupos sulfato no polissacarídeo é mais importante para a atividade anticoagulante em comparação com grupos fosfato. Palavras-chave: Polissacarídeo sulfatado, polissacarídeo fosforilado, fucogalactana, sulfatação química, fosforilação química, otimização, atividades anticoagulante e antitrombótica, fatores de coagulação.Abstract: In this thesis, results of chemical sulfation and phosphorilation of polysaccharides are presented, as well as the evaluation of anticoagulant and antithrombotic activities of the obtained molecules. A chemical sulfation optimized method was developed and applied in different polysaccharides, and APTT and PT assays were used to evaluate the sulfation process. Native and sulfated polysaccharides were characterized through analyses of monosaccharide composition, methylation, degree of substitution (DS), homogeneity and molecular weight, and RMN techniques. First, the sulfation protocol was developed with a purified and characterized fucogalactan, extracted from Agaricus bisporus mushroom. The sulfation method was optimized using chlorosulfonic acid as sulfation agent, modifying the reaction time, ratio of total reaction volume to weight of sample (VT/w), and molar ratio of sulfation agent to hydroxyl group on the polysaccharide (?ClSO3H/OH). A sulfated fucogalactan (E100) with better anticoagulant activity was obtained with a ?ClSO3H/OH ratio of 18, VT/w of 100, in 6 h of reaction. The linear increment between 15 and 45 ?g mL-1 on APTT, and 20 and 400 ?g mL-1 on PT showed that its sulfated fucogalactan has better anticoagulant activity inhibiting the contact pathway of blood coagulation. The optimized parameters of chemical sulfation were implemented in a protocol that used pyridine sulfate as sulfation agent, resulting in another sulfated fucogalactan (ESL). E100 and ESL were evaluated for the ability to inhibit the major coagulation factors targeting heparin action. Both E100 and ESL inhibited the ?-thrombin in the presence of natural inhibitors antithrombin and heparin cofactor II. ESL did not inhibit FXa in the presence of antithrombin, however, it had better inhibition over FXIIa compared to E100. Nevertheless, ESL had better anticoagulant activity on APTT, PT and TT assays. ESL showed lower DS (1.0) compared to E100 (2.8) and the NMR analyses showed that ESL had a more homogenous sulfation pattern. A greater bioavailability of ESL compared to E100 could be the reason of its grater anticoagulant activity. Posteriorly, a ?-glucan extracted from A. bisporus and citrus pectin was also sulfated by the pyridine sulfate method, following the previously optimized parameters. APTT and PT analyses showed that the sulfated fucogalactan ESL had greater anticoagulant activity in vitro compared to sulfated citrus pectin, while the sulfated ?- glucan presented lower activity. However, sulfated citrus pectin had greater antithrombotic activity in vivo compared to the sulfated fucogalactan. These results indicated that the mode of action of polysaccharides in vivo does not necessarily reflect their in vitro anticoagulant activity. Finally, two phosphorylation protocols of polysaccharides were developed, using the optimized sulfation conditions. Anticoagulant activity was found only for the phosphorylated fucogalactan obtained with the method that uses H3PO4 as phosphorylated reagent and formamidetrietylamine as reaction solvents. The results showed that the anticoagulant activity of phosphorylated fucogalactan, determined by APTT assay, was about 1000-fold lower than sulfated fucogalactans (ESL and E100). Thus, the presence of sulfate groups in the polysaccharide is more important for the anticoagulant activity than that of phosphate groups. Keywords: Sulfated polysaccharide, phosphorylated polysaccharide, fucogalactan, chemical sulfation, chemical fosforilation, optimization, anticoagulant and antithrombotic activities, coagulation factors.186 f. : il. algumas color., grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalBioquímicaPolissacarideosSangue - Fatores de coagulaçaoAnticoagulantesAtividades anticoagulante e antitrombótica de polissacarídeos sulfatados e fosforiladosinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - YONY ROMAN OCHOA.pdfapplication/pdf34070021https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/46466/1/R%20-%20T%20-%20YONY%20ROMAN%20OCHOA.pdfaf8651b33e47b4a72dfdc8c5e22b4280MD51open access1884/464662023-01-26 16:34:43.548open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/46466Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-01-26T19:34:43Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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