Desenvolvimento de nanopartículas de polihidróxibutirato carregadas com proteínas recombinantes do vírus SARS-CoV-2

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Budel, Maria Luisa Terribile, 1996-
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/77762
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos
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spelling Budel, Maria Luisa Terribile, 1996-Souza, Emanuel Maltempi de, 1964-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Müller-Santos, Marcelo, 1979-2022-09-21T19:42:39Z2022-09-21T19:42:39Z2022https://hdl.handle.net/1884/77762Orientador: Prof. Dr. Marcelo Müller dos SantosCoorientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciência Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 28/04/2022Inclui referênciasResumo: A rápida disseminação da doença COVID-19 ao redor do mundo levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a declarar uma pandemia em março de 2020. Até o início desse projeto em maio de 2020 não havia nenhum tratamento terapêutico disponível para combater o novo coronavírus, evidenciando assim a urgência no desenvolvimento de uma vacina, que foi atingido em dezembro de 2020 com as primeiras doses da vacina da Pfizer - BioNTech sendo aplicadas em cidadãos do Reino Unido. O principal alvo para o desenvolvimento da vacina contra a COVID-19 é a utilização da glicoproteína Spike, que através do domínio de ligação ao receptor celular (RBD) interage com a enzima conversora da angiotensina 2 (ECA2) do hospedeiro. O uso de nanopartículas como um sistema de entrega de antígeno e imunização vem recebendo grande atenção. O polímero bacteriano denominado polihidroxibutirato (PHB), destaca-se como uma alternativa para a síntese de nanopartículas funcionalizadas para produção de vacinas, visto que micropartículas de PHB carreando antígenos em sua superfície foram utilizadas com sucesso para a imunização de camundongos contra tuberculose e hepatite C. O objetivo desse trabalho foi produzir de forma econômica e sustentável nanopartículas funcionalizadas de PHB com antígenos do vírus SARS-CoV-2, com o intuito de desenvolver novas técnicas de imunoensaios e vacinas. Para isso foram construídos 2 plasmídeos tendo como base o vetor pET29b com cauda de 6-histidinas na porção N-terminal: o plasmídeo N-SBD com a sequência da proteína do nucleocapsídeo (N) de SARS-CoV-2 e o outro plasmídeo RBD-SBD com a sequência do domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike do SARS-CoV-2, as duas construções foram planejadas para conter a sequência do domínio de ligação do substrato (SBD) da PHB depolimerase de Alcaligenes faecalis como uma tag de ancoragem das proteínas expressas nas nanopartículas de PHB. As proteínas foram superexpressas em Escherichia. coli BL21(DE3). A proteína RBD-SBD foi purificada através da extração dos corpos de inclusão, já a proteína N-SBD foi purificada por cromatografia de afinidade a Ni2+. As nanopartículas de PHB foram produzidas através do método de nanoprecipitação por diálise lenta contra água ultrapura. As nanopartículas de PHB conjugadas com as proteínas recombinantes foram aplicadas em ensaios de Western blot e ELISA para confirmar a capacidade de serem reconhecidas por anticorpos anti-Spike e anti-N. Ensaios de imobilização com 15 µg das proteínas RBD-SBD e N-SBD nas nanopartículas de PHB confirmaram a ligação do domínio SBD nas nanopartículas de PHB. As proteínas RBD-SBD e N-SBD foram utilizadas como antígeno em ensaios de ELISA com amostras de soros diluídas em 1:2.000. Nos ensaios com a proteína RBD-SBD as amostras de soro negativo para COVID-19 apresentaram valores de fluorescência a 450 nm de 0,25, e para as amostras de soro positivo para COVID-19 apresentaram valores de fluorescência a 450 nm de 1,1. Nos ELISA com a proteína NSBD as amostras de soro negativo para COVID-19 apresentaram valores de fluorescência a 450 nm de 0,10, e para as amostras de soro positivo para COVID-19 apresentaram valores de fluorescência a 450 nm de 0,7.Abstract: The rapid spread of the COVID-19 disease around the world led the World Health Organization (WHO) to declare a pandemic in March 2020. Until the start of this work in May 2020, there was no therapeutic treatment available to combat the new coronavirus, thus highlighting the urgency in the development of a vaccine, which was reached in December 2020 with the first doses of the Pfizer – BioNTech vaccine being administered to UK citizens. The main target for development of the vaccine against COVID-19 is the use of Spike glycoprotein, which, through the cellular receptor binding domain (RBD) interacts with the host’s angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). The use of nanoparticles as an antigen delivery and immunization system has received great attention. The bacterial polymer called polyhydroxibutyrate (PHB) stands out as an alternative for the synthesis of functionalized nanoparticles for vaccine production, whereas PHB microparticles carrying antigens on their surface were successfully used to immunize mice against tuberculosis ans hepatitis C. The objective of this work was to economically and sustainable produce functionalized PHB nanoparticles with SARS-CoV-2 virus antigens, in order to develop new immunoassay and vaccine techniques. For this, 2 plamids were constructed based on the pET29b vector with a 6-His tag in the N-terminal portion: the N-SBD plasmid with the nucleocapsid protein (N) sequence of SARS-CoV-2 and the other RBD-SBD plasmid with the receptor binding domain (RBD) sequence of the Spike protein of SARS-CoV-2, the two constructs were designed to contain the substrate binding domain (SBD) sequence of the PHB depolymerase from Alcaligenes faecalis as an anchor tag of proteins expressed in PHB nanoparticles. Proteins were overexpressed in Escherichia coli BL21(DE3). The RBD-SBD protein was purified by extraction of inclusion bodies, while the N-SBD protein was purified by Ni2+ affinity chromatography. PHB nanoparticles were produced by slow dialysis nanoprecipitation method against ultrapure water. PHB nanoparticles conjugated to recombinant proteins were applied in Western blot and ELISA assays to confirm the ability to recognized by anti-Spike and anti-N antibodies. Immobilization assays with 15 µg of RBD-SBDand N-SBD proteins on PHB nanoparticles confirmed the binding of SBD domain on PHB nanoparticles. The RBD-SBD and N-SBD proteins were used as antigen in ELISA assays with serum samples diluted 1: 2.000. In assays with the RBD-SBD protein, serum samples negative for COVID-19 showed fluorescence values at 450 nm of 0,25, and for samples of positive serum for COVID-19, they showed fluorescence values at 450 nm of 1,1. In the ELISA with N-SBD protein. The negative serum samples for COVID-19 showed fluorescence values at 450 nm of 0,10, and for the positive serum samples for COVID-19, they presented fluorescence values at 450 nm of 0,7.1 recurso online : PDF.application/pdfCOVID-19 (doença)SARS-CoV-2NanopartículasPolimerosBactériasBioquímicaDesenvolvimento de nanopartículas de polihidróxibutirato carregadas com proteínas recombinantes do vírus SARS-CoV-2info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - MARIA LUISA TERRIBILE BUDEL.pdfapplication/pdf4697245https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/77762/1/R%20-%20D%20-%20MARIA%20LUISA%20TERRIBILE%20BUDEL.pdff0471ddac3f74641e385bf7e3f0cc352MD51open access1884/777622022-09-21 16:42:39.269open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/77762Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082022-09-21T19:42:39Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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