Desenvolvimento de insumos para uso diagnóstico e estudo da biologia do Zika vírus (ZIKV) através da caracterização da proteína não estrutural 1 (NS1) no curso da infecção

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Morales, Stefanny Viloche
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/86610
Resumo: Orientadora: Dra. Claudia Nunes Duarte dos Santos
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spelling Zanluca, CamilaUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularSantos, Claudia Nunes Duarte dosMorales, Stefanny Viloche2024-02-21T20:20:02Z2024-02-21T20:20:02Z2023https://hdl.handle.net/1884/86610Orientadora: Dra. Claudia Nunes Duarte dos SantosCoorientadora: Dra. Camila ZanlucaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 30/10/2023Inclui referênciasResumo: Os arbovírus (do inglês arthropod-borne virus), representam uma das principais causas de doenças infecciosas em animais e humanos e, por este motivo, causam grande impacto socioeconômico global. Sua distribuição está intimamente ligada à presença de vetores competentes, apresentando grande prevalência nas regiões tropicais e subtropicais, como é o caso do Brasil. A emergência do Zika virus (ZIKV) na Polinésia e Américas entre os anos 2013 e 2016 colocou em alerta autoridades sanitárias no mundo, devido ao seu alto potencial de dispersão geográfica e, principalmente, pelo surgimento de novas manifestações clínicas. Diferentemente de surtos anteriores, além do aumento na gravidade da doença, a infecção por ZIKV foi associada pela primeira vez com complicações neurológicas em fetos e adultos. O diagnóstico é dificultado pela baixa viremia de curta duração, assim como pela reatividade cruzada em ensaios sorológicos devido à cocirculação de orthoflavivirus filogeneticamente relacionados, como o vírus da dengue (DENV) e febre amarela (YFV). Embora a proteína não estrutural 1 (NS1) tenha sido usada como marcador de infecção aguda por DENV e para o vírus do Oeste do Nilo (WNV), pouco se sabe sobre a expressão deste antígeno durante a infecção por ZIKV. Sendo assim, neste trabalho, um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) baseado na captura de NS1 foi desenvolvido para estudar o padrão de produção e secreção deste antígeno in vitro e explorar a aplicação desta proteína como um possível marcador diagnóstico. Para isto, anticorpos monoclonais anti-NS1 foram produzidos e triados quanto a sua reatividade cruzada com outros orthoflavivirus. Os anticorpos selecionados foram produzidos em larga escala e modificados pela adição da enzima HRP. Proteínas NS1 recombinantes de ZIKV, DENV e YFV foram expressas em células S2 de Drosophila melanogaster e purificadas por cromatografia líquida de afinidade. A obtenção destes insumos possibilitou a padronização de um ELISA de captura quantitativo com limite de detecção de 19,5 ng/mL, sem reação cruzada contra os vírus YFV e DENV. Este teste foi aplicado para o estudo da dinâmica de expressão e secreção de NS1 em células C6/36, A549 e JEG-3 infectadas. Ainda que este antígeno possa ser detectado no sobrenadante de infecção, a quantificação por ELISA revelou uma maior concentração de proteína associada a células. Surpreendentemente, foi observado que nas linhagens de origem humana, a frequência de células NS1 positivas se mantém alta mesmo com uma queda significativa na infecção ao longo do tempo. Experimentos adicionais são necessários para determinar se este fenótipo é exclusivo de ZIKV ou também pode ser observado para outros orthoflavivirus. Embora mais testes com amostras humanas devam ser conduzidos para validar a aplicabilidade da detecção de NS1 para diagnóstico, os insumos produzidos neste estudo são promissores para a detecção específica de ZIKV, podendo eventualmente ser utilizados em outros ensaios diagnósticos, como imunofluorescência, imunohistoquímica e teste imunocromatográfico para aplicação point of care.Abstract: Arthropod-borne viruses (arboviruses) represent one of the leading causes of human and animal infectious disease, resulting in considerable social and economic impact globally. Their distribution is intrinsically connected to the presence of competent vectors, presenting high prevalence in tropical and subtropical regions, which is the case for Brazil. Zika virus (ZIKV) emergence in Polynesia and the Americas from 2013 to 2016 raised concerns mainly due to reports of new clinical manifestations as well as its high potential for geographic spread. In addition to heightened disease severity, ZIKV infection was associated with neurological complications in fetuses and adults for the first time. Diagnostic accuracy is undermined by the short-term low viremia as well as cross-reactivity in serological assays due to the cocirculation of closely related orthoflaviviruses, such as dengue virus (DENV) and yellow fever virus (YFV). While the non-structural protein 1 (NS1) has been used as an early marker of DENV and West Nile virus (WNV) infection, little is known about ZIKV NS1 expression. In the present work, a NS1 capture enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was developed to study in vitro synthesis and secretion patterns of this antigen and assess the application of this protein as a potential diagnostic marker. Monoclonal antibodies raised against NS1 were screened for their cross-reactivity to other orthoflaviviruses. Selected antibodies were produced on large scale and modified by the addition of the HRP enzyme. Recombinant NS1 proteins of ZIKV, DENV, and YFV were expressed in S2 Drosophila melanogaster cells and purified by affinity liquid chromatography. These reagents were used to develop a quantitative antigen capture ELISA with a limit of detection of 19.5 ng/mL and no crossreactivity to YFV, and DENV. NS1 expression and secretion dynamics in infected C6/36, A549, and JEG-3 cells were assessed with this assay. While detectable in culture supernatants, higher concentrations of this protein were predominantly cellassociated. Surprisingly, it was observed that in human cell lines, the frequency of NS1-positive cells remained high despite a significant reduction in infection over time. Additional experiments are necessary to determine if this phenotype is exclusive to ZIKV or can also be observed for other orthoflaviviruses. Although further testing with human samples is needed to validate the applicability of NS1 detection for diagnosis, the tools developed in this work are promising for specific detection of ZIKV and could be used for other diagnostic assays, such as immunofluorescence, immunohistochemistry, and an immunochromatographic test for point of care application.1 recurso online : PDF.application/pdfInfecção pelo Zika vírusEnsaio de Imunoadsorção EnzimáticaDiagnostico virologicoMorfologiaDesenvolvimento de insumos para uso diagnóstico e estudo da biologia do Zika vírus (ZIKV) através da caracterização da proteína não estrutural 1 (NS1) no curso da infecçãoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - STEFANNY LUCIA VILOCHE MORALES.pdfapplication/pdf14386373https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/86610/1/R%20-%20T%20-%20STEFANNY%20LUCIA%20VILOCHE%20MORALES.pdf543e74ee90ef8862dba0926865ca6666MD51open access1884/866102024-02-21 17:20:03.008open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/86610Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-02-21T20:20:03Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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