Caracterização química e avaliação da atividade citotóxica de glucosinolatos e imunomoduladora de polissacarídeos de maca peruana (Lepidium meyenii WALPERS)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lenzi, Raquely Moreira
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/87250
Resumo: Orientadora: Dra. Juliana Bello Baron Maurer
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spelling Petkowicz, Carmen Lúcia de Oliveira, 1963-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Maurer, Juliana Bello BaronLenzi, Raquely Moreira2024-03-27T17:36:28Z2024-03-27T17:36:28Z2019https://hdl.handle.net/1884/87250Orientadora: Dra. Juliana Bello Baron MaurerCoorientadora: Profa. Dra. Carmen Lúcia de Oliveira PetkowiczTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa: Curitiba, 27/09/2019Inclui referências: p. 84-93Resumo: Lepidium meyeni Walpers, conhecida como maca peruana é um alimento e planta medicinal nativa dos Andes, que tem ganhado destaque mundial em função das propriedades afrodisíacas, energéticas e imunoestimulantes relatadas para essa planta. Entretanto, há um consenso de que os benefícios atribuídos ao consumo da maca não apresentam embasamento científico suficiente. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi obter e caracterizar frações da maca ricas em duas classes de compostos com potencial bioativo: glucosinolatos (GLs) (I) e polissacarídeos (II), a fim de se investigar suas respectivas atividades biológica em ensaios in vitro. (I) As frações ricas em glucosinolatos intactos foram obtidas através de extração hidroetanólica e fracionamento através de partição líquido-líquido seguida de cromatografia em sílica gel, e monitoradas por CCD e CLAE. Glucotropaeolina (GTR) e glucolimnantina (GLM) foram identificadas através da combinação de técnicas cromatográficas aliadas à espectrometria de massas (CLAE, MS, LC-MS/MS). O excesso de açúcares livres co-eluídos com os GLs foi removido por extração em fase sólida utilizando mini cartuchos C18, dando origem às frações ricas em GLs: Lm-II (GTR=195,4 µg/mg) e Lm-III (GTR=169,9 µg/mg e GLM = 66,6 µg/mg), as quais foram avaliadas em um ensaio de citotoxicidade (MTT) combinado com a enzima mirosinase (MYR). Ambas frações foram citotóxicas para as linhagens humanas de carcinoma hepatocelular (HepG2/C3A) e adenocarcinoma de cólon (HT-29). Os efeitos citotóxicos foram verificados apenas nos experimentos com frações submetidas à etapa de limpeza do açúcar e quando na presença de MYR. Os valores de IC50 obtidos para Lm-II e Lm-III foram de 118,8 e 69,9 µg/mL para HepG2/C3A e 102,6 e 71,5 µg/mL para HT29, respectivamente. Estes resultados sugerem que os produtos de degradação dos GLs pela MYR são os responsáveis pela citotoxicidade. (II) As frações polissacarídicas da maca foram obtidas através da extração sequencial utilizando H2O 55 ºC (4 h), H2O 85 ºC (2 h), e NaOH 1 M, 2 M e 4 M utilizando a farinha de maca pré-inativada (EtOH 70%), deslipidificada (tolueno:EtOH) e livre de amido (degradação enzimática com ?-amilase e amiloglucosidase). Todas as frações apresentaram Ara, Gal, Man e Glc em sua composição, e adicionalmente as frações de hemiceluloses A e B exibiram também Xyl. As frações MP-Ws-R (MW 298 kDa), MP-HW (PM 2720 kDa) e MP- 1Ab (MW 1680 kDa) apresentaram um teor de arabinogalactana-proteínas (AGPs) de 34,3 ± 0,5, 14,6 ± 1,4 e 30,2 ± 1,1%, respectivamente. Considerando as análises químicas e de RMNHSQC, sugere-se a presença de arabinogalactana tipo II (AG-II) e xiloglucanas nas frações polissacarídicas da maca. Os assinalamentos característicos para AG-II corroboraram com os resultados obtidos em relação ao teor de AGP. Os efeitos exercidos sobre as vias clássica e alternativa do sistema complemento foram avaliados pelo ensaio hemolítico e comparados ao controle de inibição (heparina). Com pré-incubação, os IC50 da heparina, MP-Ws-R, MP-HW e MP-1Ab foram de 40; 204,9; 303,8 e 886,9 µg/mL para a via clássica (VC), e 280,2; 224,4; 411,8 e 387 µg/mL para a vi alternativa (VA), respectivamente. Diferente da heparina, nenhuma fração apresentou atividade nos ensaios sem pré-incubação, indicando que as frações MP-Ws- R, MP-HW e MP-1Ab atuam como ativadores da via clássica e da via alternativa do sistema complemento. Estes resultados poderão contribuir para o fortalecimento da maca como um "superalimento" e para o desenho de futuros estudos com foco na abordagem terapêutica.Abstract: Lepidium meyeni Walpers, known as Peruvian maca, is an Andes native crop used as food and for medicinal proposes. Maca has gained worldwide prominence due its related aphrodisiac, energetic, and immunostimulant properties. Nevertheless, the benefits attributed to maca consumption cannot be entirely supported from a scientific standpoint. In this context, the aim of this study was to obtain and characterize maca fractions of (I) glucosinolates (GLs) and (II) polysaccharides, in order to investigate their respective in vitro biological activities. (I) Intact GL-enriched fractions were obtained by ethanolic aqueous extraction, followed by liquid-liquid partition and silica gel chromatography. Thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis were used to monitor the obtainment of maca GL-enriched fractions. After free sugar clean-up step (by solid phase extraction using C18 cartridges), Lm-II and Lm-III fractions were obtained. The identification of the GLs was performed with combined chromatographic and mass spectrometry approaches (HPLC, mass spectrometry (MS), liquid chromatography-MS/MS). Glucotropaeolin (GTR) and glucolimnanthin (GLM) were identified on both fractions. These fractions were used on biological assay to evaluate their cytotoxicity on two tumoral human cell lines in absence (- MYR) and presence of myrosinase (+MYR). MYR converts GLs to their products such as isothiocyanates (ITCs). Lm-II (GTR=195.4 µg/mg) and Lm-III (GTR=169.9 µg/mg and GLM = 66.6 µg/mg), were cytotoxic for both, human hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) and colon adenocarcinoma (HT-29) cell lines. Cytotoxicity effects were only observed in the experiments with fractions submitted to free-sugar cleaning step and when MYR was added to culture medium. The IC50 values, corresponding to the half-maximal inhibitory concentration of Lm-II and Lm-III (on +MYR assay), were 118.8 and 69.9 µg/mL for HepG2/C3A and 102.6 and 71.5 µg/mL for HT29, respectively. These results suggested that GLs breakdown products formed by MYR can be responsible for the cytotoxic effects. (II) Maca polysaccharide fractions were obtained by sequential extraction performed with H2O at 55 oC, H2O at 85 oC, 1 M, 2 M and 4 M NaOH, using an inactivated (EtOH 70%), defatted (toluene:EtOH) and starch-free flour (?-amylase e amyloglucosidase). Arabinose, galactose, and glucose were the main monosaccharide constituents in the water-soluble fractions (MP-Ws-R and MP-HW) and in the alkaline fractions (correspondent to hemicelluloses A and B), which presents additionally xylose. MP-Ws-R (MW 298 kDa), MP-HW (MW 2720 kDa) and MP-1Ab (MW 1680 kDa) fractions showed an AGP content of 34.3±0.5, 14.6±1.4 and 30.2±1.1%, respectively. Considering chemical and NMR analysis it can be suggested the presence of arabinogalactan type II (substituted with Rha, 4-O-Me-GlcA) and xyloglucans on the maca polysaccharide fractions. The characteristic AG-II assignments corroborated with the results obtained regarding the AGP content. Their modulatory effects on the classical (AP) and alternative (AP) pathways of the complement system (CS) was accessed by the haemolytic fixation test and comparing with heparin (inhibition control). With pre-incubation, the IC50 of heparin, MP-Ws- R, MP-HW and MP-1Ab were 40.0, 204.9, 303.8 and 886.9 µg/mL for classical pathway (CP); and 280.2, 224.4, 411.8 and 387 µg/mL for alternative pathway (AP), respectively. Unlike heparin, no fraction showed activity in assays performed without pre-incubation, indicating that MP-Ws-R, MP-HW and MP-1Ab fractions act as activators of the CP and the AP of the complement system. These results may contribute to strengthening maca as a "superfood" and to the design of future studies focusing on the therapeutic approach.1 recurso online : PDF.application/pdfPolissacarideosToxicidadeBioquímicaCaracterização química e avaliação da atividade citotóxica de glucosinolatos e imunomoduladora de polissacarídeos de maca peruana (Lepidium meyenii WALPERS)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - RAQUELY MOREIRA LENZI.pdfapplication/pdf9721156https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/87250/1/R%20-%20T%20-%20RAQUELY%20MOREIRA%20LENZI.pdff5a889bd3ad09651f5cb7fe447e96eebMD51open access1884/872502024-03-27 14:36:29.029open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/87250Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-03-27T17:36:29Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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