Caracterização das topoisomerases Illa E IIIB de Trypanosoma cruzi

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Umaki, Adriana Castilhos Souza
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/35038
Resumo: Orientadores : Dr. Stenio Perdigão Fragoso, Dr. Marco Aurélio Krieger
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spelling Umaki, Adriana Castilhos SouzaKrieger, Marco AurelioUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularFragoso, Stenio Perdigão2018-04-20T18:50:22Z2018-04-20T18:50:22Z2013http://hdl.handle.net/1884/35038Orientadores : Dr. Stenio Perdigão Fragoso, Dr. Marco Aurélio KriegerTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/09/2013Inclui referênciasResumo: DNA topoisomerases catalizam a interconversão de isômeros topológicos de DNA e são necessárias para a resolução de estresse torcional no DNA e para a liberação de moléculas concatenadas. DNA topoisomerase III pertence à subfamília IA das topoisomerases que catalizam a remoção de superenovelamentos negativos através da clivagem de DNA simples fita. As topoisomerases III participam de processos celulares como replicação, recombinação homóloga e reparo de DNA e são importantes para a manutenção da integridade do genoma. Neste trabalho nós investigamos as topoisomerases III de Trypanosoma cruzi (TcTOPO3_ e TcTOPO3_). Para avaliar a função de TcTOPO3, nós inativamos sequencialmente ambos os alelos de cada um dos genes substituindo-os por cassetes contendo marcadores de seleção (neo ou Higro) através de recombinação homóloga. Nós observamos que mutantes para ambos os genes TcTOPO3 são viáveis, entretanto o mutante Tctopo3_ exibe dificuldade no crescimento, enquanto o mutante Tctopo3_ cresce de forma similar aos parasitas selvagens, sugerindo as enzimas TOPO3 possuem diferentes funções na célula e que uma enzima não pode substituir a outra em suas funções. Com a finalidade de avaliar a resposta à danos celulares em mutantes TOPO3 de T. cruzi submetemos os parasitas ao inibidor de replicação hidroxiurea (HU). Nossas análises por citometria de fluxo mostraram que mutantes Tctopo3 são capazes de progredir no ciclo celular inclusive após exposição a altas doses de HU (30 mM), enquanto os parasitas selvagens permaneceram estagnados na fase G1, sugerindo que ambas as TOPO3 são necessárias para a resposta do DNA à danos e o bloqueio da replicação, provavelmente agindo nos pontos de verificação da fase G1/S. O mutante Tctopo3_ foi tratado com a fleomicina (um agente que induz a quebra da dupla fita) e mostrou uma menor sensibilidade a fleomicina comparado com os parasitas selvagens. Novamente esse resultado nos indica que TOPO3_ provavelmente está envolvida com sinalização de danos no DNA. Nós questionamos também se os mutantes Tctopo3 produzem um fenótipo de hiperrrecombinação, uma vez que pelo menos 50% do genoma de T. cruzi é representado por um grande número de elementos repetitivos e membros de famílias multigênicas. Para as analises utilizou-se eletroforese de campo pulsado e sondas radioativas de DNA satélite e genes de regiões subteloméricas de T. cruzi, os resultados demonstraram que pelo menos para as sondas utilizadas não houve alterações significativas no cariótipo dos mutantes Tctopo3 quando comparado com os parasitas selvagens. Topoisomerase III_ eucariótica foi relatada estando associada com duas outras proteínas SGS1 e RMI1/2, em um complexo chamado RTM (RecQ-family helicase, Topoisomerase III _, e RMI1/2). O complexo RTR garante a integridade genômica influenciando em vários aspectos incluindo a replicação do DNA, recombinação meiótica e mitótica e a dinâmica dos telômeros. Uma das maiores funções do complexo RTR é a remoção de intermediários de recombinação que podem ser acumulados durante esses processos. Nós nos perguntamos então se as enzimas TOPO3 de T. cruzi estão associadas com o reparo do DNA ou proteínas de checagem do ciclo celular. Para tanto, TcTOPO3 (_ e _) contendo uma etiqueta FLAG foram expressas ectopicamente em formas epimastigotas de T. cruzi. As proteínas TOPO3-FLAG foram imunoprecipitadas usando um anticorpo monoclonal anti-FLAG seguido de análises em espectrometria de massas para a identificação de proteínas associadas. Foram identificadas várias proteínas envolvidas em vias metabólicas citoplasmáticas e mitocondriais sem relação aparente com sinalização de danos ao DNA ou atividades celulares específicas. Entretanto, complexos contendo as enzimas TcTOPO3 devem ser dinâmicos e encontrados em pequenas quantidades dentro da célula, fato que explicaria dificuldade na caracterização de proteínas parceiras associadas a elas.Abstract: DNA topoisomerases catalyze the interconversion of topological isomers of DNA and are required for the resolution of torsional stress in DNA and for the unlinking of topologically intertwined molecules. DNA topoisomerase III belongs to the type IA subfamily of topoisomerases, which catalyze the removal of negative DNA supercoils by cleaving single-strand DNA. Topoisomerases III play roles in cellular processes, such as replication, homologous recombination and DNA repair. These enzymes are important for the maintenance of genome integrity. In this study, we investigated the topoisomerases III from Trypanosoma cruzi (TcTOPO_ and TcTOPO_). To explore the role of TcTOPO3, we sequentially inactivated both alleles of each gene by placing cassettes containing selectable markers (neo or higro resistance genes) into the middle of TcTOPO3 genes through homologous recombination. Viable mutants for both TcTOPO3 genes were obtained, however we observed that Tctopo3_ mutant displays growth defects, whereas the growth of Tctopo3_ mutant was similar to the wildtype cells, suggesting that each TOPO3 enzyme plays distinct roles into the cell and one enzyme could not replace the other in its functions. We therefore investigated whether T. cruzi TOPO3 enzymes are important to cell cycle progression, by assessing the response of the null topo3 mutants to the replication inhibitor hidroxyurea (HU). Flow cytometry analyses show that HUtreated tctopo3 mutants are able to progress into the cell cycle even with high doses of HU (30 mM), whereas wild-type cells are stalled in G1 phase. This result suggests that both TOPO3 are required for the response to DNA damage and replication block, probably acting in G1/S checkpoint. Topo3_ mutant was also treated with the double strand break (DSB)-inducing agent phleomycin and shows less sensitivity to phleomycin than the wild-type cells. Again, this result indicates that TOPO3_ might be involved in the signaling DNA damage. We asked whether Tctopo3 mutants display a hyperecombination phenotype as well, as at least 50% of T. cruzi genome is represented by large number of repetitive elements and members of multigenic families. Tctop3 chromosomes were separated by pulsed-field electrophoresis and hybridized with radioactive probes of satelite DNA and genes from subtelomeric regions of T. cruzi. Our result showed that at least for the probes used no significative changes in the Tctop3 caryotipe was observed as compared with the wild-type parasites. Eukaryotic topoisomerase III_ is found associated with two other proteins, SGS1 and RMI1/2, in a complex called RTM (RecQ-family helicase a Topoisomerase III _, and RMI1/2). The RTR complex safeguards genome integrity by influencing various aspects, including DNA replication, mitotic and meiotic recombination, and telomere dynamics. One of major functions of the RTR complex is to remove recombination intermediates that may accumulate during these processes. Thus, we asked whether T. cruzi TOPO3 enzymes are associated with DNA repair or cell cycle checkpoint proteins. TcTOPO3 (_ and _) enzymes were ectopic expressed in T. cruzi epimastigote forms as FLAG epitope-tagged proteins. TOPO3-FLAG proteins were immunoprecipitated using a monoclonal anti-FLAG epitope followed by mass spectrometry analysis to identify the individual components. As expected, both TOPO3-FLAG proteins were present in the pool of proteins that were immunoprecipitated, many of which are involved in cytoplasm or mitochondrial metabolic pathways with have no apparent correlation with DNA damage signaling or cell cycle activities. However, complexes with TcTOPO3 enzymes might be dynamic and found in low quantities into a cell which may explain the lack of the already well characterized proteins partners associated to them.116f. : il. algumas color., grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesDNA TopoisomerasesTrypanosoma cruziCitologia e biologia celularBiologia molecularCaracterização das topoisomerases Illa E IIIB de Trypanosoma cruziinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - ADRIANA CASTILHOS SOUZA UMAKI.pdfapplication/pdf27863543https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/35038/1/R%20-%20T%20-%20ADRIANA%20CASTILHOS%20SOUZA%20UMAKI.pdfaaa37c5c26dd56b81b9a4168c5b65e9cMD51open accessTEXTR - T - ADRIANA CASTILHOS SOUZA UMAKI.pdf.txtExtracted Texttext/plain229596https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/35038/2/R%20-%20T%20-%20ADRIANA%20CASTILHOS%20SOUZA%20UMAKI.pdf.txt01bc6f5482c33197784c72967c832b07MD52open accessTHUMBNAILR - T - ADRIANA CASTILHOS SOUZA UMAKI.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1131https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/35038/3/R%20-%20T%20-%20ADRIANA%20CASTILHOS%20SOUZA%20UMAKI.pdf.jpga10e266db7fe89929e767374b68ae9c4MD53open access1884/350382018-04-20 15:50:22.643open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/35038Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082018-04-20T18:50:22Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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