Aplicação da RMN no estudo das interações entre toxinas urêmicas e a albumina humana
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Tese |
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| Texto Completo: | https://hdl.handle.net/1884/70870 |
Resumo: | Orientador: Prof. Dr. Andersson Barison |
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Menezes, Leociley Rocha Alencar, 1991-Sassaki, Guilherme Lanzi, 1975-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Exatas. Programa de Pós-Graduação em QuímicaBarison, Andersson, 1975-2021-12-13T20:04:42Z2021-12-13T20:04:42Z2019https://hdl.handle.net/1884/70870Orientador: Prof. Dr. Andersson BarisonCoorientador: Prof. Dr. Guilherme Lanzi SassakiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa : Curitiba, 22/04/2019Inclui referências: p. 76-86Resumo: A doença renal crônica (DRC) é uma síndrome caracterizada pela redução progressiva da capacidade de filtração glomerular do organismo. Esse processo causa o acúmulo de diversos compostos orgânicos que através de reações e interações com as proteinas presentes no organismo podem causar danos em vários tecidos e órgãos. O presente estudo teve como finalidade empregar a ressonância magnética nuclear (RMN) aliada a calorimetria de titulação isotérmica (ITC) na avaliação das interações intermoleculares das toxinas urêmicas p-cresil sulfato (PCS) e indoxil sulfato (IS) com a proteína albumina sérica humana (HSA). Dessa forma, o experimento de RMN STD foi empregado para realizar o mapeamento dos epítopos dos ligantes e a determinação das constantes de dissociação de ambas as toxinas, bem como avaliar a influência da temperatura e da força iônica nessas interações. Além disso, foi realizado o ensaio de competição entre o PCS e o diazepam (inibidor do sítio II da HSA). O mapeamento dos epítopos através do experimento de RMN STD mostrou que os hidrogênios H-3/5 e H-5 do PCS e IS, respectivamente, são os que apresentam maior proximidade com o sítio de ligação da proteína. Através da determinação das constantes de dissociação (PCS: Kd = 6,5 mM e 4,8 mM a 25 ºC) foi observada uma afinidade moderada de ambas as toxinas com a HSA purificada revelando a maior afinidade da IS pela proteína. Também foi possível observar que a temperatura e a força iônica causam o aumento da interação do IS com a HSA purificada (Kd = 2,4 mM a 37 ºC e 2,3 mM a 25 ºC), respectivamente. Enquanto para o PCS o aumento da temperatura resultou na diminuição da interação com HSA (Kd = 8,5 mM a 37 ºC) e o aumento da força iônica não afetou essa interação (Kd = 6,8 mM a 25 ºC). Esses resultados sugerem que a HSA purificada pode ainda conter resquício de acetiltriptofanato de sódio e caprilato de sódio e que esses compostos afetam de formas distintas a interação das toxinas urêmicas com a HSA. Na ausência desses compostos, observou-se um aumento da afinidade de ambas as toxinas (PCS: Kd = 2,9 mM e IS: Kd = 3,1 mM a 25 ºC) com a HSA (? 99% de pureza), corroborando a hipótese de que a presença dos resquícios de acetiltriptofanato de sódio e caprilato de sódio interferem de modo que diminuem a afinidade do PCS e IS com HSA. O ensaio de competição indicou que o PCS tem afinidade pelo sítio II da HSA. Através dos experimentos de ITC foi possível a determinação dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos dessas interações. Com relação aos dados termodinâmicos obtidos pelo ITC, foi observado que a ligação do PCS e IS com a HSA envolve interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Além disso, observou-se que a interação desses compostos com a proteína é governada principalmente pela contribuição entálpica o que sugere a presença de ligações de hidrogênio ou interações de Van der Waals entre essas moléculas e a proteína. Dessa forma, o experimento de RMN STD aliado a ITC permitem o entendimento das forças que regem as interações de PCS e IS com a HSA e esses resultados podem auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para aumentar a remoção desses compostos do organismo dos pacientes acometidos pela DRC. Palavras-chave: RMN STD. ITC. Interações intermoleculares. Ligantes. Proteínas.Abstract: Chronic kidney disease (CKD) is a syndrome characterized by the progressive reduction of the body's glomerular filtration capacity. This process causes the accumulation of various organic compounds that, through reactions and interactions with proteins present in the body, can cause damage to various tissues and organs. This work intended to apply nuclear magnetic resonance (NMR) and isothermal titration calorimetry (ITC) to evaluate the intermolecular interactions of uremic toxins p-cresyl sulfate (PCS) and indoxyl sulfate (IS) with the protein human serum albumin (HSA). Therefore, the experiment of saturation-transfer difference (STD) NMR was adopted to perform epitopes mapping of ligands and determine dissociation constants of both toxins and the influence of temperature and ionic strength on these interactions. Besides, the competition assay between PCS and diazepam (site II inhibitor of HSA) was performed. Epitopes mapping using STD NMR experiment showed that hydrogens H-3/5 of PCS and H-5 of IS are the nearest to the protein binding site. A moderate affinity of both toxins with the purified HSA was revealed by determining dissociation constants (PCS: Kd = 6,5 mM and 4,8 mM, 25 ºC), suggesting a higher affinity of IS with the protein. Furthermore, it was possible to observe that the temperature and ionic strength cause increased interaction between IS and purified HSA (Kd = 2,4 mM at 37 ºC and 2,3 mM at 25 ºC, respectively). For PCS, temperature increment resulted in decreased interaction with HSA (Kd = 8,5 mM at 37 ºC), and the increase of ionic strength did not affect this interaction (Kd = 6,8 mM at 25 ºC). These results suggest that purified HSA may present some vestiges of sodium acetyltryptophanate and sodium caprylate, and those compounds affect in distinct ways interactions of uremic toxins with HSA. In the absence of those compounds, it was observed an increase in affinity for both toxins (PCS: Kd = 2,9 mM and IS: Kd = 3,1 mM at 25 ºC) with HSA (?99% of purity), corroborating with the hypothesis of the affinity decrease of PCS and IS with HSA interfered by the presence of vestiges of sodium acetyltryptophanate and sodium caprylate. The competition test indicated the affinity of PCS with site II of HSA. ITC experiments enabled the determination of the kinetic and thermodynamic parameters of those interactions. In relation to the thermodynamic data obtained by the ITC, it was observed that linkage of PCS and IS with HSA involves electrostatic and hydrophobic interactions. Therefore, it was indicated that the interaction of these compounds with the protein is controlled mainly by the enthalpic contribution that suggests the presence of hydrogen bonds or Van der Waals interactions between these molecules and the protein. Lastly, STD NMR experiment combined with ITC allows the knowledge of strengths that rule interactions of PCS and IS with HSA, and those results can assist the development of therapeutics strategies to increase the removal of these compounds from people committed by chronic kidney disease (CKD). Keywords: NMR STD. ITC. Intermolecular interactions. Ligands. Proteins.1 arquivo (86 p.) : PDF.application/pdfRessonancia magnetica nuclearProteínasQuímicaAplicação da RMN no estudo das interações entre toxinas urêmicas e a albumina humanainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - LEOCILEY ROCHA ALENCAR MENEZES.pdfapplication/pdf3789863https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/70870/1/R%20-%20T%20-%20LEOCILEY%20ROCHA%20ALENCAR%20MENEZES.pdf301caf809d24b276cd0cbe18b4ce9900MD51open access1884/708702021-12-13 17:04:42.809open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/70870Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082021-12-13T20:04:42Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false |
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