Clonagem e expressão de toxina pertencente à familia das notinas presente no veneno de Aranha-Marrom (Loxosceles intermedia)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Meissner, Gabriel Otto
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/28343
Resumo: Orientadora : Profa. Dra. Olga Meiri Chaim
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spelling Meissner, Gabriel OttoVeiga, Silvio Sanches, 1962-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e MolecularChaim, Olga Meiri2018-04-23T18:10:49Z2018-04-23T18:10:49Z2012http://hdl.handle.net/1884/28343Orientadora : Profa. Dra. Olga Meiri ChaimCo-orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 29/02/2012Bibliografia: fls. 59-69ResumoResumo: As aranhas-marrons pertencem ao gênero Loxosceles que são representadas no Brasil pela existência de dez espécies de aranhas desse gênero. No Estado do Paraná, já foram descritas quatro dessas espécies, sendo que três delas, L. intermedia, L. laeta e L. gaucho, são consideradas de maior importância médica devido aos acidentes que causam. A L. intermedia é a espécie mais abundante em Curitiba e Região Metropolitana e também é responsável pelo maior número de acidentes envolvendo aranha-marrom. O veneno dessas aranhas é uma mistura cristalina de peptídeos, proteínas e enzimas de baixa massa molecular (5 - 40 kDa), sendo que as enzimas mais estudadas são as fosfolipases-D. Existem muitos peptídeos com atividade inseticida que foram descritos como componentes de venenos de aranhas, escorpiões, anêmonas e caracóis. Em veneno de L. intermedia, já foram identificados e purificados alguns peptídeos inseticidas. Recentemente, o transcriptoma de glândulas de veneno dessa espécie revelou que 24,1% do total de transcritos codificantes de toxinas referem-se a diversos peptídeos potencialmente inseticidas. O presente trabalho enfoca o estudo de um peptídeo presente no veneno de L. intermedia que é semelhante a uma neurotoxina (NTX), pois possui similaridade na sequência aminoacídica predita de 48,9% quando comparada com uma toxina inibidora de canal de sódio de insetos encontrada na aranha Macrothele gigas. A análise bioinformática da toxina em questão revelou massa molecular de ~10,4 kDa, a possível existência de cinco pontes dissulfeto e sua classificação como pertencente a família das notinas. A clonagem molecular da sequência de interesse foi realizada em dois diferentes vetores de expressão, pET-14b e pET-32a.A expressão em pET-14b foi favorecida em meio de cultura mais ricoquando comparado ao convencional Luria-Bertani, denominado meio Triptona fosfato, o qual ésuplementado com glicose. A expressão em pET-32a teve ótimo rendimento em meio triptona fosfato, porém o peptídeo se encontrava em corpos de inclusão. Diversas cepas de expressão de E.coli foram testadas para melhorar o rendimento. As cepas AD494 e Rosetta-gami não foram muito eficientes para produção do peptídeo pela quantidade produzida ou pela solubilidade. A cepa que apresentou o melhor rendimento e solubilidade na expressão foi a Shuffle T7 express lysY com pET-14b. Diferentes métodos de purificação do peptídeo recombinante foram testados, mas ainda com baixa eficiência. Os problemas de expressão foram praticamente resolvidos e novos protocolos de purificação são promissores para obtenção do peptídeo recombinante para testes biológicos. O interesse biotecnológico em clonar, expressar e caracterizar essas toxinas inseticidas presentes no veneno de L. intermedia é devido ao fato que a partir disso pode se tentar desenvolver um agente inseticida que não gere resistência como os inseticidas químicos e ainda que apresente baixa toxicidade para mamíferos.Abstract: Brown spiders belong to Loxosceles genus.In Brazil, ten species of Loxosceles are found. At the State of Paraná s were already described four species including the three most important for envenoming, which are L. laeta, L. intermedia and L. gaucho species. L.intermedia is not only the most numerous specie in Curitiba and neighboring but also causes the large number of envenoming accidents with brown spider. Loxosceles venom is a mixture of peptides, proteins and enzymes with low molecular mass (5 - 40 kDa). The best characterized toxinsare the Phospholipases-D. Peptides with insecticidal activity are found in different venoms such as spiders, scorpions, cone snail and sea anemone. For the L. intermedia venom, there are some reported insecticidal peptides. Recently, the transcriptome of venom gland showed that 24.1% of all toxins codify transcripts which are from peptides potentially insecticides. Here we will focus in the study of a peptide from the L. intermedia venom that has 48.9% of similarity in predict amino acidic sequence with a neurotoxin found in Macrothele gigas venom. The bioinformatics analysis of sequence showed a peptide with~10,4kDa of expected molecular mass, five intrachain disulfide bonds and one putative site for N-glycosylation. The molecular cloning of this sequence was performed in two expression vectors, pET-14b and pET-32a. The expression with pET-14b showed better results in rich medium supplemented with glucose, triptone phosphate, when compared with Luria-Bertani medium. pET-32a showed the best result in mass of peptide produced in triptone phosphate medium expression, but the peptides were in inclusion body. Several E. coli strains were tried to reach a best expression. AD494 and Rosetta-gami strains were not efficient in mass produced or solubility of recombinant peptide. The strain that showed the best results for mass produced and solubility was Shuffle T7 express lysY with pET-14b vector. For purification of peptide several protocols were tried with low success up to now. The expression problems were almost solved and new purification protocol has a great potential in peptide obtention for biological tests. The biotechnological interest in insecticidal peptides from L. intermedia venom leads to the possibility of new insecticidal compounds developing, specially aiming to avoid plague resistance as seen for chemicals compounds and minimizing collateral effects upon mammal animals.68f. : il. [algumas color.], grafs., tabs.application/pdfDisponível em formato digitalTesesAranha - VenenoEcologiaClonagem e expressão de toxina pertencente à familia das notinas presente no veneno de Aranha-Marrom (Loxosceles intermedia)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - GABRIEL OTTO MEISSNER.pdfapplication/pdf2985049https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/28343/1/R%20-%20D%20-%20GABRIEL%20OTTO%20MEISSNER.pdfedfbe7e51f93ecdf4f3107edd66c5643MD51open accessTEXTR - D - GABRIEL OTTO MEISSNER.pdf.txtExtracted Texttext/plain127567https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/28343/2/R%20-%20D%20-%20GABRIEL%20OTTO%20MEISSNER.pdf.txt5792c45a1bafaeb9170920392722d44fMD52open accessTHUMBNAILR - D - GABRIEL OTTO MEISSNER.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1082https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/28343/3/R%20-%20D%20-%20GABRIEL%20OTTO%20MEISSNER.pdf.jpg77e518423f9f747a90d5146d2615af20MD53open access1884/283432018-04-23 15:10:49.581open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/28343Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082018-04-23T18:10:49Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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