Identificação de litigantes para a proteína correspondente do transcrito b2a2 do cromossomo philadelphia : perspectivas para diagnóstico e monitoramento da doença residual mínima em leucemias

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Yamanaka, Isabel Biasi
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1884/48727
Resumo: Orientadora : Profª Drª Juliana Ferreira de Moura
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spelling Yamanaka, Isabel BiasiAlvarenga, Larissa MagalhãesUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia BásicaMoura, Juliana Ferreira de2017-08-21T21:29:59Z2017-08-21T21:29:59Z2014http://hdl.handle.net/1884/48727Orientadora : Profª Drª Juliana Ferreira de MouraCoorientadora : Profª Drª Larissa M. AlvarengaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 27/08/2014Inclui referências : f. 66-72Resumo: O cromossomo Philadelphia, encontrado principalmente em pacientes com leucemia mieloide crônica (LMC), expressa diferentes transcritos BCR-ABL1, sendo o principal deles o b2a2. Esses transcritos codificam proteínas que possuem atividade tirosina-quinase constitutivamente ativa e, consequentemente, ativam múltiplas cascatas resultando no desencadeamento da doença. Atualmente as principais metodologias empregadas no diagnóstico e monitoramento da LMC utilizam técnicas de biologia molecular que apresentam uma série de desvantagens tais como custo, necessidade de mão de obra qualificada, falta de sensibilidade e, ainda, não quantificam a proteína quimérica BCR-ABL1, a qual é o principal fator indutor da doença, principalmente porque a quantidade de RNAm não é fiel ao montante da quimera. No presente estudo, buscou-se identificar ligantes da proteína referente ao transcrito b2a2 que pudessem ser aplicados na detecção e quantificação da proteína BCR-ABL1, fornecendo um diagnóstico preciso além de uma alternativa para o monitoramento da doença residual mínima. Portanto, utilizou-se a técnica de Phage Display a fim de se obter peptídeos expressos em fagos com afinidade para um peptídeo sintético correspondente ao fragmento correspondente ao transcrito b2a2 (pepb2a2). Para tanto, diferentes estratégias de seleção desses peptídeos foram utilizadas, sendo a mais eficaz aquela em que se utilizou uma solução ácida concomitantemente à sonicação para a eluição. Foram identificados dois clones (25S e 13S) cujas reatividades frente ao pepb2a2 foram confirmadas por ELISA com absorbâncias de 0,97 e 1,34, respectivamente, próximas a absorbância de 1,30 do controle positivo (anticorpo monoclonal anti-b2a2). Ambos os clones apresentaram reatividade dose-dependente frente ao pepb2a2 confirmando a afinidade, fenômeno que também foi confirmado pelo ELISA de competição no qual os clones foram capazes de inibir a ligação ao anticorpo monoclonal em 27,15% e 38,12%, respectivamente. A especificidade ao pepb2a2 foi verificada quando se utilizou como alvo dois outros fragmentos BCR-ABL-1 cujas absorbâncias para o pepb3a2 foram de 0,18 e 0,26 e para o pepe1a2 foram de 0,36 e 0,42, respectivamente. Esses clones, após sequenciamento, poderão ter suas sequências amioacídicas sintetizadas e acopladas a enzimas ou nanopartículas com o intuito de testá-las frente a linhagens de células comerciais que expressam BCR-ABL1 e de pacientes. Esse trabalho é pioneiro na utilização da interação peptídeo-peptídeo na seleção de ligantes para fins diagnósticos e é primeiro passo para a elaboração de novos métodos para detecção de células remissivas na doença residual mínima em leucemias. Palavras chaves: phage display; leucemia mieloide crônica; peptídeo; diagnóstico; monitoramento; doença residual mínima.Abstract: The Philadelphia chromosome, found mainly in patients with chronic myeloid leukemia (CML), expresses different BCR-ABL1 transcripts, the b2a2 being the main one. These transcriptsencode proteins that have constitutively active tyrosine kinase activity and are able to active multiple cascades resulting on development of the disease. Currently the diagnostic and monitoring methods of CML use molecular biology techniques which have a number of disadvantages, such as cost, qualified professionals and lack of sensitivity. They do not quantify the chimeric protein BCR-ABL1, which is the main driving factor, and also the amount of mRNA is not equivalent to the amount of chimera. In the present study, we aimed to identify ligands of b2a2 transcript that could be applied in the detection and quantification of BCR-ABL1 protein, providing an accurate diagnosis as well as an alternative for monitoring minimal residual disease. Therefore, we used the phage display technique to obtain peptides expressed on phage with affinity for a synthetic peptide corresponding to the b2a2 transcript (pepb2a2). Different selection strategies were used for these peptides and the most effective one used an acid solution simultaneously with sonication for elution. Two clones (25S and 13S) had their reactivity to pepb2a2 confirmed by ELISA absorbance values of 0,97 and 1,34, respectively, close to absorbance value of 1,30 to the positive control (anti-b2a2 antibody). Both clones showed dose-dependence reactivity to pepb2a2 confirming their affinity, which was also confirmed by competition ELISA in which the clones were able to inhibit monoclonal antibody binding to 27,15% and 38,12%, respectively. The specificity to pepb2a2 was observed when using two other target BCR-ABL-1 transcripts whose reactivity to pepb3a2 were 0,18 and 0,26 and the pepe1a2 were 0,36 and 0,42, respectively. These clones once sequenced may have their aminoacid sequences synthesized and coupled to enzymes or nanoparticles in order to test them against commercial BCR-ABL1 cell lines and patients. This work is the first to use the peptide-peptide interaction in the selection of ligands for diagnostic purposes and is a first step towards the development of new methods for detection of remissive cells in minimal residual disease in leukemia. Keywords: phage display; chronic myeloid leukemia; peptide; diagnostics; monitoring; minimal residual disease.77 f. : il. algumas color., grafs., tabs.application/pdfDisponível também em formato digitalMicrobiologiaParasitologiaLeucemia mieloide de fase cronicaPeptídeosDiagnósticoIdentificação de litigantes para a proteína correspondente do transcrito b2a2 do cromossomo philadelphia : perspectivas para diagnóstico e monitoramento da doença residual mínima em leucemiasinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - ISABEL BIASI YAMANAKA .pdfapplication/pdf2922297https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/48727/1/R%20-%20D%20-%20ISABEL%20BIASI%20YAMANAKA%20.pdf094d270ca32c8b870a436aab220f8174MD51open access1884/487272017-08-21 18:29:59.788open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/48727Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082017-08-21T21:29:59Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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