Método de detecção e caracterização de transgenes inseridos em Eucalyptus geneticamente modificado

• Autor(a) principal: Marques, Raíssa Volpatto
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/183893
• topic: Eucalyptus; Plantas transgênicas; Marcadores moleculares; GMO; Molecular markers; AFLP; Eucalypts; Transgene detection; Transgenic plants

Os Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) ou transgênicos ganharam destaque mundial em decorrência de suas várias aplicações e benefícios gerados. Plantas GM foram desenvolvidas com características como a maior resistência a doenças e pragas; a maior tolerância a estresses abióticos; o maior incremento de conteúdo nutricional; e, também, no desenvolvimento de produtos como fármacos peptídicos e metabólitos secundários. Nos últimos anos houve um aumento significativo no número de países que adotou o cultivo de plantas GM, chegando, em 2014, a 28 países produtores. As agências reguladoras de plantas transgênicas e de outros OGMs de diversos países, porém, exigem uma série de testes e análises de segurança para que estes organismos sejam liberados para o cultivo e a comercialização. Análises baseadas na detecção e na caracterização do DNA exógeno inserido no genoma das plantas, visando determinar os locais de integração e o número de cópias integradas, fazem parte das típicas exigências destas agências reguladoras. Estes testes são realizados principalmente por técnicas como a hibridização de Southern blot e a reação em cadeia da DNA polimerase (PCR). Estes métodos, no entanto, apresentam limitações no seu uso e na qualidade e aproveitamento dos resultados gerados, sendo necessário o desenvolvimento de novas metodologias de análise. Pelo presente trabalho, teve-se por objetivo o desenvolvimento de um novo método de detecção e caracterização de eventos de transformação de plantas GM em substituição às técnicas previamente citadas. A estratégia proposta faz uso dos marcadores moleculares denominados “Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos Amplificados” (do inglês, Amplified Fragment Length Polymorphism ou AFLP). Para desenvolvimento e teste da nova metodologia, foi realizada a extração de DNA de amostras de folhas de Eucalyptus GM e não-GM. Testes qualitativos e quantitativos, atestando a pureza das amostras de DNA, foram realizados a fim de dar continuidade aos experimentos com AFLP. Foram realizados o planejamento e a projeção de primers e adaptadores específicos às sequências do DNA exógeno integrado nas plantas. Uma vez estabelecidos todos os materiais e passos necessários para iniciar a técnica de AFLP, a reação de clivagem do DNA genômico e a ligação dos adaptadores aos fragmentos gerados foi cumprida com sucesso e, assim, seguiu-se com as análises via PCR. Para a constatação da eficácia e sucesso da técnica, produtos da PCR foram analisados por eletroforese capilar em um sequenciador de DNA ABI-3500 (Applied Biosystems). Assim, foi possível avaliar o número de fragmentos gerados pelas combinações de 14 diferentes primers testados. A combinação do primer MseI-AG gerou um número maior de fragmentos e, desta forma, foi escolhido para as análises iniciais. Pela comparação dos fragmentos obtidos de mais de uma amostra de DNA, pode-se fazer uma correlação entre a ausência e a presença dos picos gerados. Assim, os fragmentos que se mostrarem exclusivos nas amostras, isto é, presentes ou ausentes, indicarão os possíveis transgenes inseridos no genoma de Eucalyptus. Foi possível obter uma variedade de tamanhos de fragmentos pelo primer MseI-AG. Os fragmentos de 79, 100 e 378 pares de bases foram detectados em amostras únicas de Eucalyptus, sendo específicos para cada amostra avaliada. Por serem exclusivos de cada amostra, esses fragmentos possivelmente indicam ser originados dos transgenes inseridos no genoma de Eucalyptus GM. Estes estudos ainda são preliminares e devem ser realizados na presença de uma amostra controle (Eucalyptus não-GM), que se conheça os tamanhos de fragmentos, para a correta detecção dos fragmentos gerados por Eucalyptus GM. Logo, para o melhor aperfeiçoamento da nova tecnologia proposta, um maior número de amostras de plantas GM e não-GM serão analisadas.