Caracterização bioquímica dos homólogos de glutamina sintetase em Paenibacillus sonchi SBR5

• Autor(a) principal: Vargas, Alvina Fernanda de
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/253717
• topic: Nitrogênio; Glutamato-amônia ligase; Paenibacillus riograndensis SBR5; Nitrogen

A enzima glutamina sintetase (GS), peça-chave no metabolismo do nitrogênio, apresenta papel primordial na biossíntese de L-glutamina e assimilação desse elemento para a grande maioria das bactérias. GS atua como catalisadora da reação que forma L-glutamina a partir de ácido L-glutâmico e amônio, sendo necessário gasto de ATP para tal. Dessa maneira, o íon amônio é introduzido ao metabolismo celular pela GS e pela glutamato sintase, produzindo L-glutamina e L-glutamato, respectivamente. O gênero Paenibacillus é alvo de diversos estudos; no entanto, ainda se fazem necessárias mais análises genômicas, tendo em vista sua importância para a biotecnologia e o agronegócio, ampla distribuição, função nas comunidades microbianas e fixação de nitrogênio, observada em várias espécies do gênero. Paenibacillus riograndensis (SBR5), sinônimo heterotípico posterior de P. sonchi (X19-5 T), bactéria isolada de trigo (Triticum aestivum), quando comparada a outras do gênero apresenta peculiaridades. SBR5 contém, em seu genoma, três genes codificadores de proteínas homólogas à GS (nomeadas no presente estudo como “GSs-like” – GSL1, GSL2 e GSL3). Este estudo visa à caracterização das funções de tais proteínas. Para a expressão das três proteínas (GSL1, GSL2 e GSL3) foi utilizada Escherichia coli BL-21 e o plasmídeo pASKIBA3, a qual foi confirmada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Utilizando-se o resina (meio) StrepTactinTM SepharoseTM High Performance (GE Healthcare), as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade. Após a purificação e diálise das proteínas, as mesmas foram quantificadas pelo método de Bradford e armazenadas à -20°C, para posterior análise. Foi utilizado o método colorimétrico baseado na liberação de fosfato inorgânico (Pi) resultante da hidrólise de ATP para medição da atividade biossintética das GSs-like. Observou-se atividade de 11,6 e 9,63 nmol Pi/mg para GSL1 e GSL2, respectivamente, enquanto GSL3 não apresentou atividade biossintética. Tendo em vista uma possível semelhança entre as GSs em questão e outras proteínas caracterizadas na literatura, foi realizado um ensaio colorimétrico para verificar atividade na presença de poliaminas como substrato, em substituição ao amônio. Foi observada atividade para as três GSs-like, em diferentes níveis, mostrando a capacidade dessas enzimas em utilizar poliaminas como fonte de nitrogênio. Testando-se possíveis inibidores foi notada inibição de GSL1 apenas por glutamina, sendo as outras proteínas estimuladas pelos demais substratos avaliados.